本发明专利技术涉及一种CNTF突变体及其修饰型突变体和应用。所述CNTF突变体是在天然CNTF的氨基酸序列的基础上发生突变得到的，所述突变包括：第26位的赖氨酸突变为异亮氨酸或亮氨酸、第46位的赖氨酸突变为精氨酸、第160位的赖氨酸突变为谷氨酰胺或蛋氨酸；并且其中所述CNTF突变体保留了天然CNTF第40位的赖氨酸。通过本发明专利技术的CNTF突变体能够获得修饰专一性高的修饰型CNTF，从而克服因修饰而带来的修饰产物不均一、结果不稳定等问题，并使重组CNTF蛋白结构稳定，与天然蛋白相比具有更高的生物学活性和可溶性，并且修饰型CNTF与未修饰型CNTF相比具有长效作用。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，具体而言，涉及一种修饰型睫状神经营养因子突变体、DNA、重组表达载体、遗传工程宿主细胞、修饰型睫状神经营养因子突变体、所述睫状神经营养因子突变体以及修饰型睫状神经营养因子突变体的应用、药物组合物。
技术介绍
睫状神经营养因子(Ciliaryneurotrophicfactor,简称CNTF)因为最初是从鸡的睫状体中提取出来，并可维持鸡副交感神经节的存活而得名。CNTF全长由200个氨基酸组成，第17位有Cys，无分子内二硫键，无糖基化位点。CNTF全长分子量在23KD左右。在体内以两个二聚体形式进行储存，经过酶解成单体后发生生物学作用。CNTF可以促进包括：运动神经元、感觉神经元、交感神经元、海马神经元等多种神经细胞和神经胶质细胞的生长和分化。90年代，在将CNTF用于治疗肌肉萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)的实验研究中发现，对一组ALS患者进行临床研究发现病人的体重大大降低，使用药物组体重比安慰剂组明显降低。而且这一结果持续整个研究过程。针对这一结果在肥胖症领域进行实验，结果表明CNTF在体内可与下丘脑的特异性受体结合，激活抑制食欲的关键信号通路，抑制进食欲望且使机体不会产生饥饿感，从而使体重减轻。研究发现，CNTF具有多种功能，能促使多种神经细胞的存活、营养肌肉、促进糖、脂代谢和调节能量平衡以及摄食行为。在神经系统，肌肉系统，肥胖症极其相关疾病的治疗中具有重要意义和广阔的临床前景。CNTF是本领域技术人员所熟知的，通常使用CNTF突变体解决CNTF的生物活性不高以及表达量低的问题。因此，目前现有技术中已开发出了多种CNTF的突变体(或称变异体)，多种重组人睫状神经营养因子是市售的。CNTF突变体或变异体的制备方法在现有技术中也是已知的，例如中国专利CN1687413A公开了一种CNTF突变体(hCNTF)，第17位的半胱氨酸突变为丙氨酸；第63位的谷氨酰胺突变为精氨酸；第64位的组氨酸突变为丙氨酸；并去除了C末端1-30个氨基酸。CN1760205A公开了一种CNTF突变体(hCNTF)，第17位半胱氨酸突变为丝氨酸，并去除了C端的16个氨基酸；而且第53位的丙氨酸突变为缬氨酸，第35位的苏氨酸突变为蛋氨酸，第178位的苯丙氨酸突变为缬氨酸。CN1844392也公开了睫状神经营养因子的突变体。但上述CNTF的突变体或变异体仍存在体内的作用时间短，要求反复多次给药；免疫原性强副反应严重，给病人带来巨大的经济压力和精神压力的缺点。因此，目前选择使用PEG修饰后的蛋白，其有以下优势：分子量增大、半衰期延长、免疫原性降低。PEG拥有独特的亲-疏水平衡：当偶联到药物分子表面时，将其优良性质赋予修饰后的药物，改变它们在水溶液中的生物分配行为和溶解性，在其修饰的药物周围产空间屏障，减少药物的酶解。覆盖蛋白表面的抗原决定簇，降低蛋白的免疫原性。这样，可以增加蛋白的分子量和体积，减少肾小球的滤过作用，使蛋白在体内作用时间更长。聚乙二醇(PEG)于1940年首次商业生产化。PEG的使用通过了美国FDA认证，符合美国药典(USP)、国家处方集(NF)、食品化学法典(FCC)标准，被广泛应用于食品、饲料、个人护理品、化学、医药化工等生产生活领域。利用PEG类修饰剂修饰CNTF或CNTF突变体的最大的问题在于，修饰位点不稳定，如在20种构成CNTF的常见氨基酸中，具有极性的氨基酸残基的侧链基团都能够进行化学修饰，包括赖氨酸、半胱氨酸、组氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸等；而且以上几种极性氨基酸的N-端氨基和C-端羧基也可以进行修饰，这样会使得很难获得稳定的修饰位点和修饰方式，导致修饰的专一性降低与修饰的稳定性下降。而且修饰位点往往处于蛋白质的活性中心部位，因此修饰后蛋白活性损失较大。另外，根据2015版药典的质量要求，治疗性蛋白的PEG修饰需专一位点的修饰。然而，无论是天然的全长CNTF还是上述专利申请开发的CNTF突变体，均无法提供唯一的修饰位点。
技术实现思路
为解决上述现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种修饰型睫状神经营养因子突变体、DNA、重组表达载体、遗传工程宿主细胞、修饰型睫状神经营养因子突变体、所述睫状神经营养因子突变体以及修饰型睫状神经营养因子突变体的应用、药物组合物。具体而言，本专利技术提供了：(1)一种睫状神经营养因子突变体，其中，所述睫状神经营养因子突变体是在天然睫状神经营养因子的氨基酸序列的基础上发生突变得到的，所述突变包括：第26位的赖氨酸突变为异亮氨酸或亮氨酸、第46位的赖氨酸突变为精氨酸、第160位的赖氨酸突变为谷氨酰胺或蛋氨酸；并且其中所述睫状神经营养因子突变体保留了天然睫状神经营养因子第40位的赖氨酸。(2)根据(1)所述的睫状神经营养因子突变体，其中，所述突变包括：第26位的赖氨酸突变为亮氨酸、第46位的赖氨酸突变为精氨酸、第160位的赖氨酸突变为谷氨酰胺。(3)根据(1)或(2)所述的睫状神经营养因子突变体，其中，所述突变还包括：第17位半胱氨酸突变为丙氨酸、第63位谷氨酰胺突变为精氨酸、以及去除天然睫状神经营养因子C末端的15个氨基酸。(4)根据(1)所述的睫状神经营养因子突变体，其中，所述的睫状神经营养因子突变体具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。(5)一种DNA，其中，所述DNA的核苷酸序列为编码根据(1)至(4)中任一项所述的睫状神经营养因子突变体的核苷酸序列。(6)根据(5)所述的DNA，其中，所述DNA的核苷酸序列为SEQIDNO:3所示的核苷酸序列。(7)一种重组表达载体，其中，所述重组表达载体含有(5)或(6)所述的核苷酸序列。(8)根据(7)所述的重组表达载体，其中，所述重组表达载体为PET24a+/CNTFnew/Clys3表达载体。(9)一种遗传工程宿主细胞，其中，所述宿主细胞含有(7)或(8)所述的重组表达载体。(10)根据(9)所述的遗传工程宿主细胞，其中，所述宿主细胞为CNTFnew/Clys3工程菌。(11)一种修饰型睫状神经营养因子突变体，其中，所述的修饰型睫状神经营养因子是通过对根据(1)至(4)中任一项所述的睫状神经营养因子突变体的第40位赖氨酸进行定点修饰而得到的，所述定点修饰是通过在所述的第40位赖氨酸上结合化学修饰剂而实现的。(12)根据(11)所述的修饰型睫状神经营养因子突变体，其中，所述化学修饰剂为聚乙二醇或聚乙二醇类聚合物。(13)根据(11)所述的修饰型睫状神经营养因子突变体，其中，所述的化学修饰剂选自：聚乙二醇、甲氧基聚乙二醇、甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺琥珀酸酯、甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺碳酸酯、甲氧基聚乙二醇三氟乙基磺酸酯、甲氧基聚乙二醇-丙醛、甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺丙酸酯、甲氧基聚乙二醇-琥珀酰亚胺-α-甲基丁酸酯、甲氧基聚乙二醇-N-羟基琥珀酰亚胺、甲氧基聚乙二醇-马来酰亚胺或甲氧基聚乙二醇-乙醛。(14)根据(11)所述的修饰型睫状神经营养因子突变体，其中，所述化学修饰剂为甲氧基聚乙二醇-乙醛。(15)根据(1)至(4)中任一项所述的睫状神经营养因子突变体在制备用于治疗和/或预防肥胖症或与肥胖症相关的疾病的药物中的应用。(16本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种睫状神经营养因子突变体，其中，所述睫状神经营养因子突变体是在天然睫状神经营养因子的氨基酸序列的基础上发生突变得到的，所述突变包括：第26位的赖氨酸突变为异亮氨酸或亮氨酸、第46位的赖氨酸突变为精氨酸、第160位的赖氨酸突变为谷氨酰胺或蛋氨酸；并且其中所述睫状神经营养因子突变体保留了天然睫状神经营养因子第40位的赖氨酸。
【技术特征摘要】
1.一种睫状神经营养因子突变体，其中，所述睫状神经营养因子突变体是在天然睫状神经营养因子的氨基酸序列的基础上发生突变得到的，所述突变包括：第26位的赖氨酸突变为异亮氨酸或亮氨酸、第46位的赖氨酸突变为精氨酸、第160位的赖氨酸突变为谷氨酰胺或蛋氨酸；并且其中所述睫状神经营养因子突变体保留了天然睫状神经营养因子第40位的赖氨酸。2.根据权利要求1所述的睫状神经营养因子突变体，其中，所述突变包括：第26位的赖氨酸突变为亮氨酸、第46位的赖氨酸突变为精氨酸、第160位的赖氨酸突变为谷氨酰胺。3.根据权利要求1或2所述的睫状神经营养因子突变体，其中，所述突变还包括：第17位半胱氨酸突变为丙氨酸、第63位谷氨酰胺突变为精氨酸、以及去除天然睫状神经营养因子C末端的15个氨基酸。4.根据权利要求1所述的睫状神经营养因子突变体，其中，所述的睫状神经营养因子突变体具有SEQIDNO:4所示的氨基酸序列。5.一种DNA，其中，所述DNA的核苷酸序列为编码根据权利要求1-4中任一项所述的睫状神经营养因子突变体的核苷酸序列。6.根据权利要求5所述的DNA，其中，所述DNA的核苷酸序列为SEQIDNO:3所示的核苷酸序列。7.一种重组表达载体，其中，所述重组表达载体含有权利要求5或6所述的核苷酸序列。8.根据权利要求7所述的重组表达载体，其中，所述重组表达载体为PET24a+/CNTFnew/Clys3表达载体。9.一种遗传工程宿主细胞，其中，所述宿主细胞含有权利要求7或8所述的重组表达载体。10.根据权利要求9所述的遗传工程宿主细胞，其中，所述宿主细胞为CNTFnew...
【专利技术属性】
技术研发人员：王健，柳森，李素贞，郑秀玉，蔡觅，张夕燕，晁华，于世荣，
申请(专利权)人：北京生物制品研究所有限责任公司，国药中生生物技术研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11
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