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【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及疫苗检测,具体涉及一种百日咳毒素等电点的检测方法及其在分析样品稳定性及批间一致性中的应用。
技术介绍
1、百日咳(pertussis,whooping couge)是一种由百日咳杆菌( bordetella pertussis)引起的能够严重危害婴幼儿健康的烈性呼吸系统传染病。百日咳在发病早期不易诊断,但极具感染性,具有难以控制传染源及传播途径的特点,故疫苗接种是最理想的防治手段。百日咳杆菌为革兰阴性菌,不仅产生内毒素和外毒素,而且还产生具有不同生物学活性的物质,包括百日咳毒素(pertussis toxin、pt)、丝状血凝素(filamentoushaemagglutinin,fha)、百日咳黏附素(pertactin,prn)、百日咳菌毛蛋白(fimbriae,fim)、腺苷酸环化酶(adenylate cyclase toxin,act)、气管毒素(tracheal cytotoxin,tct)、皮肤坏死毒素(dermonecrotictoxin,dnt)和脂多糖(lipopolysacchairide,lps)等。其中pt、fha、prn作为保护性抗原成分,已成为组分无细胞百日咳疫苗(acelluar pertussisvaccine,apv)及相关联合疫苗研发和生产过程中的主要成分。
2、pt是百日咳杆菌的主要致病因子,在对机体的致病及免疫等方面都起着重要的作用。pt为a-b型结构的毒素,相对分子质量为117×1
3、蛋白质作为两性分子,在不同ph环境中氨基酸侧链所带的电荷不同。当处于某一ph时,蛋白质分子的净电荷为零,这一ph称为该蛋白质的等电点(isoelectric point,pi)。pi是蛋白质的理化常数,取决于蛋白质分子的氨基酸组成和构象。不同蛋白质的pi范围很宽,根据pi的不同可以进行蛋白质的鉴定、分离和表征。pi也能够反映蛋白类药物电荷异质性,可体现蛋白质药物的电荷与空间构象的均一性情况,同时可以利用不同异构体pi的差异对其进行分离和定量分析。目前,蛋白质pi的理论值可根据其氨基酸组成计算获得,而实际值主要采用电泳法测定,主要为等电聚焦技术,其中较常用的平板等电聚焦电泳(isoelectric focusing electrophoresis,ief)。近年来,随着毛细管电泳技术的快速发展,毛细管等电聚焦电泳(capillary isoelectric focusing,cief)越来越多地被应用于蛋白质pi的检测及表征。成像毛细管等电聚焦电泳(imaged capillary isoelectricfocusing,icief)具有聚焦时间短、可实时观察样品聚焦分离情况、能够及时调整聚焦时间和样品浓度等参数及方法重现性优良等优点,故越来越广泛地应用于蛋白质类药物的表征及质量控制。
4、作为百日咳杆菌的主要致病因子,pt抗原在动物试验和临床试验均具有良好的免疫保护性。作为组分无细胞百日咳疫苗的重要成分,在疫苗生产制备过程中,需对其进行分离纯化及质量控制,但现有的表征方法较单一,常用聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)分析其制备纯度及表观分子量,具有耗时长,灵敏度低,相关试剂对人体毒害性高等不足;ief常用于测定蛋白质的pi,但具有重现性差,聚焦时间冗长及制样过程繁杂等不足。
5、综上,需开发一种基于成像毛细管等电聚焦电泳表征pt抗原品pi的分析方法,并进行方法学验证,以期为pt抗原的pi测定及样品的分析如样品稳定性及批间一致性等质量表征提供依据。
技术实现思路
1、为解决上述问题,本专利技术的目的是提供一种pt抗原表征方法。
2、为实现上述目的,本专利技术采用了如下技术方案:
3、一方面,本专利技术提供了一种检测百日咳毒素样品的方法,其包括:
4、(1)将百日咳毒素样品制备成上样溶液;所述上样溶液中包含:百日咳毒素、尿素、亚氨基二乙酸、精氨酸、两性电解质、等电点标记物、甲基纤维素;
5、(2)对所述上样溶液进行等电聚焦,获得等电聚焦图谱,确定样品中百日咳毒素的等电点。
6、根据本专利技术的具体实施方式,所述的百日咳毒素样品为待测pt抗原样品。pt抗原是无细胞百日咳疫苗的关键成分。在本专利技术中,待测pt抗原样品为由百日咳杆菌发酵后的上清液经纯化获得的用于制备无细胞百日咳疫苗的pt抗原溶液或干粉。通常情况下,纯化得到的样品为溶液时,样品中pt抗原浓度为0.5mg/ml~10mg/ml。本专利技术的样品也可以是干粉,用水或缓冲液溶解至0.5mg/ml~10mg/ml后可进行检测。
7、在本专利技术的实施例中,发酵、纯化的方法如下:
8、(1)百日咳菌株发酵培养,收获培养液上清;(2)从培养液上清中分离纯化pt抗原。
9、根据本专利技术的具体实施方式,上样溶液中,尿素的浓度为8m。
10、根据本专利技术的具体实施方式,采用毛细管电泳仪对所述上样溶液进行等电聚焦。
11、根据本专利技术的具体实施方式,检测的过程实时成像。
12、根据本专利技术的具体实施方式,所述的获得等电聚焦图谱为在荧光模式下获取等电聚焦图谱,所述的荧光模式的条件包括:检测波长为320~450nm,曝光时间为3~10s。
13、根据本专利技术的具体实施方式,曝光时间为3s。
14、根据本专利技术的具体实施方式,所述的两性电解质溶液的ph值为3-10。
15、根据本专利技术的具体实施方式,所述的两性电解质为pharmalyte。作为一种优选的实施方式,上样溶液中,pharmalyte的浓度为4%。
16、根据本专利技术的具体实施方式,所述的等电聚焦的条件包括:聚焦电压为3000v,聚焦时间为5.5~10 min,优选为10min。
17、根据本专利技术的具体实施方式,等电聚焦的聚焦温度为15~25℃。在本专利技术的具体实施例中,等电聚焦的聚焦温度为20℃。
18、作为一种优选的实施方式,等电聚焦前还进行预聚焦,预聚焦电压为1500v,预聚焦时间为1 min。
19、根据本专利技术的具体实施方式,上样溶液中,亚氨基二乙酸的浓度为10~15mm。作为一种优选的实施方式,上样溶液中,亚氨基二乙酸的浓度为10mm。
20、根据本专利技术的具体实施方式,上样溶液中,精氨酸的浓度为10~15mm。作为一种优选的实施方式,上样溶液中,精氨酸的浓度为10mm。
21、根据本专利技术的具体实施方式,所述的等电点标记物包括4.05 pi marker、10.17p本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种检测百日咳毒素样品的方法,其包括:
2.根据权利要求1所述的方法,其中,上样溶液中,尿素的浓度为8M。
3.根据权利要求1所述方法,其中,采用毛细管电泳仪对所述上样溶液进行等电聚焦。
4.根据权利要求3所述的方法,其中,所述的获得等电聚焦图谱为在荧光模式下获取等电聚焦图谱,所述的荧光模式的条件包括:检测波长为320~450nm,曝光时间为3~10s。
5.根据权利要求1所述的方法,其中,所述的两性电解质为Pharmalyte。
6.根据权利要求1所述的方法,其中,所述的等电聚焦的条件包括:聚焦电压为3000V,聚焦时间为10min。
7. 根据权利要求1所述的方法,其中,所述的等电点标记物包括4.05 PI Marker、10.17 PI Marker。
8.根据权利要求1所述的方法,其中,上样溶液中,两性电解质的浓度为1%~8%,亚氨基二乙酸的浓度为10~15mM,精氨酸的浓度为10~15mM,等电点标记物的浓度为0.2%~2%,甲基纤维素的浓度为0.2~0.5%。
9.根据
10.根据权利要求1所述的方法,上样溶液中,百日咳毒素的浓度为60~100μg/ml。
...【技术特征摘要】
1.一种检测百日咳毒素样品的方法,其包括:
2.根据权利要求1所述的方法,其中,上样溶液中,尿素的浓度为8m。
3.根据权利要求1所述方法,其中,采用毛细管电泳仪对所述上样溶液进行等电聚焦。
4.根据权利要求3所述的方法,其中,所述的获得等电聚焦图谱为在荧光模式下获取等电聚焦图谱,所述的荧光模式的条件包括:检测波长为320~450nm,曝光时间为3~10s。
5.根据权利要求1所述的方法,其中,所述的两性电解质为pharmalyte。
6.根据权利要求1所述的方法,其中,所述的等电聚焦的条件包括:聚焦电压为3000v,聚焦时间为10min。
7. 根据权利要求1所述的方法,其中...
【专利技术属性】
技术研发人员:李世慧,何鹏,王玲,於洋,陈丝丝,张娜,杨柏峰,张云涛,
申请(专利权)人:北京生物制品研究所有限责任公司,
类型:发明
国别省市:
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