一种吸附型疫苗中羧甲基葡聚糖含量的检测方法技术

本发明专利技术提供了一种吸附型疫苗中羧甲基葡聚糖含量的检测方法，其包括如下步骤：预处理疫苗样品，得到上样溶液；采用高效液相色谱系统对所述上样溶液进行上机检测，采用外标法计算得到甲基葡聚糖含量；其中，色谱条件包括：色谱柱为TSKgel G2500PW 300

【技术实现步骤摘要】
一种吸附型疫苗中羧甲基葡聚糖含量的检测方法


[0001]本专利技术涉及疫苗检测
，具体涉及一种吸附型疫苗中羧甲基葡聚糖含量的检测方法。

技术介绍

[0002]酵母β
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葡聚糖是一种功能性多糖，能有效地激活巨噬细胞，诱导机体产生一系列免疫应答反应，因此广泛用于医药、食品、化妆品、饲料等行业。目前，从酵母细胞壁分离酵母β
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葡聚糖已实现产业化，但其水溶性较差。羧甲基葡聚糖(carboxymethylated glucan,CMG)是酵母葡聚糖的羧甲基化衍生物，具有较高的水溶性，极大拓展了葡聚糖在各个行业的应用范围。目前，CMG已被作为佐剂应用于部分疫苗中，显著增强了疫苗的抗原特异性体液免疫效应和细胞免疫效应。CMG是含有CMG吸附型疫苗产品的重要成分之一，其质量控制十分关键。但目前尚未有CMG在制品中定量检测方法的国家标准和行业标准。
[0003]现有技术常用酸解或酶解法测定粗多糖含量作为质量控制标准，此类方法只能以葡萄糖进行折合计算，测定结果粗糙，专属性较差，尤其可能受到不同制品体系中其它辅料的干扰；利用(1
→
3)
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β
‑
D
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葡聚糖与特定单克隆抗体结合的免疫分析方法可测定血液等生物样品中的β
‑
D
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葡聚糖，但其检测成本较高，且灵敏度过高，重复性较差；利用荧光物质与β
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葡聚糖专一性结合的荧光法可在一定范围内根据结合物荧光强度的增量判定β<br/>‑
葡聚糖的含量，但荧光剂稳定性较差，且蛋白等杂质对检测结果影响较大；凝胶渗透色谱与示差折光检测器或蒸发光检测器连用广泛应用于糖类等高分子物质的检测，示差折光检测器能够测定葡聚糖纯度及不同分子量葡聚糖的含量，但该方法对温度、压力等环境条件过于敏感，基线噪音过大，且不适用于梯度洗脱，蒸发光检测器可较好的支持梯度洗脱，但价格较高，操作繁琐，且灵敏度较低。
[0004]具体地，现有的羧甲基葡聚糖的检测方法存在如下缺点：
[0005]现有技术一：
[0006]化学水解法：使用硫酸将多糖水解为单糖，通过检测葡萄糖单体含量测定多糖含量。糖类在较高温度下可与浓硫酸作用脱水生成糠醛或羟甲基糠醛，该物质与蒽酮脱水缩合形成的糠醛衍生物在620nm处有最大吸收，该物质与苯酚缩合形成的橙黄色化合物在490nm处有最大吸收，这些有色产物的吸光度与可溶性糖含量成正比，样品测定时需配制不同浓度的葡萄糖溶液作为标准品，通过标准曲线及多糖与单糖的系数比计算得到样品中的多糖含量。该技术存在的缺点是：浓硫酸几乎可以和所有的碳水化合物反应，不同分子量及结构的多糖经浓硫酸处理后将无差别的分解为单糖，该方法只能测定总糖含量，无法分辨多聚糖中的杂质。此外，未知多糖与单糖的系数难以确定，无法准确得出总多糖含量，计算误差较大。
[0007]现有技术二：
[0008]生物水解法：使用专一性水解酶切断葡聚糖的β
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1，3键和β
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1，4键，使β
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葡聚糖降解为葡萄糖单体，氧化酶法可将该单体转化为有色物质，其吸光度在特定波长下与葡萄糖
含量成正比，也可使用高效液相色谱法检测其含量，间接得到多糖含量。该技术存在的缺点是：不同分子量及结构的多糖均可通过β
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1，3键和β
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1，4键连接，酶解后测得的单糖含量无法分辨多聚糖中的杂质，无法测得特定分子量或结构的多糖的纯度。此外，高纯度的酶试剂价格昂贵，检测成本较高。
[0009]现有技术三：
[0010]刚果红法：刚果红为一种红色染料，与β
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葡聚糖的结合物在550nm处有最大吸光度，该吸光值随着葡聚糖浓度的增加而改变。样品测定时需在一定浓度的刚果红溶液中加入不同含量的标准β
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葡聚糖建立标准曲线，进而测得样品中的葡聚糖含量。该技术存在的缺点是：刚果红与葡聚糖的结合不是特异性的，含量检测结果易受到不同分子量及结构的葡聚糖的干扰，准确度较低，且该方法无法测定目标葡聚糖的纯度。
[0011]现有技术四：
[0012]荧光法：荧光剂Calcofluor和β
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葡聚糖能特异性结合形成复合物，体系溶液的荧光强度与β
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葡聚糖浓度有关。样品测定时需采用标准β
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葡聚糖溶液建立浓度－荧光强度标准曲线，进而计算得到样品中β
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葡聚糖含量。该技术存在的缺点是：荧光剂Calcofluor易光分解，稳定性较差，且不同制品体系复杂，蛋白质等成分将对检测结果产生干扰。
[0013]现有技术五：
[0014]免疫分析法：单克隆抗体可与含特定聚合表位的β
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葡聚糖特异性结合，利用该原理可采用酶联免疫吸附的方法检测微量的β
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葡聚糖含量。将具有待测葡聚糖聚合表位的多糖作为抗原溶解于磷酸盐等缓冲溶液中，使用该溶液免疫动物进而筛选制备相应的单克隆抗体。该方法可用于血液等生物样品中微量β
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葡聚糖含量的测定。该技术存在的缺点是：该方法特异性强，灵敏度极高，用于葡聚糖含量较高的复杂样品检测时稳定性及重复性较差，此外，由于需要特定的单克隆抗体，检测成本较高。
[0015]现有技术六：
[0016]凝胶渗透色谱
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示差折光检测法：凝胶渗透色谱是一种根据尺寸分离高分子材料的色谱技术，不同分子大小的葡聚糖经凝胶渗透色谱分离后流入检测器，样品溶液与纯溶剂的折射率不同使示差折光检测器捕捉到样品信号，检测器的一室为参比溶剂，另一室为样品溶液，溶液的折射率与样品的组分及浓度相关。该技术存在的缺点是：凝胶渗透色谱
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示差折光检测法根据样品溶液与参比溶剂的折射率差异测定样品浓度，对实验条件要求较高，温度、压力等因素对检测结果影响较大，检测基线噪音过大，灵敏度过低，部分方法定量限达0.6mg/mL，无法满足微克级别的多糖含量测定。此外，由于对参比溶剂折射率的依赖，该方法不适用于梯度洗脱，对复杂系统中葡聚糖分离方法的改进造成了一定困难。
[0017]现有技术七：
[0018]凝胶渗透色谱
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蒸发光检测法：不同分子大小的葡聚糖经凝胶渗透色谱分离后随流动相进入蒸发光检测器，液体流动相在检测器的载气压力下雾化，随后在漂移管中蒸发除去，未蒸发的溶质颗粒穿过光检测池的激光束，其散射的光通过光电倍增管搜集并转化为样品信号，通过不同分子量及浓度的葡聚糖标准品制成的标准曲线可较好的计算出样品中不同分子量范围的葡聚糖含量及纯度。该技术存在的缺点是：蒸发光检测器需要氮气等载气提供装置，检测器内部可能存在溶质残留，操作及维护复杂且成本较高。蒸发光检测的原理要求流动相的挥发性应高于目标待测物。此外，与紫外检测法相比，该方法检测灵敏性
较低。
[0019]上述现有技术一、二主要通过本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种吸附型疫苗中羧甲基葡聚糖含量的检测方法，其包括如下步骤：预处理疫苗样品，得到上样溶液；采用高效液相色谱系统对所述上样溶液进行上机检测，采用外标法计算得到羧甲基葡聚糖含量；其中，色谱条件包括：色谱柱为TSKgel G2500PW 300
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7.5mm色谱柱，柱温为20
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30℃；流动相为0.18
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0.22M磷酸盐缓冲液，流速为0.8
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1.2mL/min，进样量为50μL以上，洗脱时间为10min以上；检测波长为215
±
5nm。2.根据权利要求1所述的吸附型疫苗中羧甲基葡聚糖含量的检测方法，其中，所述吸附型疫苗中含有CpG佐剂和/或氢氧化铝佐剂。3.根据权利要求1所述的吸附型疫苗中羧甲基葡聚糖含量的检测方法，其中，所述吸附型疫苗中还含有新冠病毒抗原。4.根据权利要求1所述的吸附型疫苗中羧甲基葡聚糖含量的检测方法，其中，所述外标法包括进样不同浓度的羧甲基葡聚糖标准曲线工作液，根据标准曲线工作液的检测结果拟合得到标准物浓度和标准物峰面积之间的...

【专利技术属性】
技术研发人员：王辉，朱迪，朱秀娟，丁玲，梁宏阳，李娜，曹佳睿，冀璇，郑晓彤，袁光英，
申请(专利权)人：北京生物制品研究所有限责任公司，
类型：发明
国别省市：