本发明专利技术公开了一种同时分离内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞和表皮细胞的原代培养方法，皮肤成纤维细胞株和表皮细胞株的构建包括以下步骤：(1)采样；(2)内蒙古白绒山羊耳尖皮肤组织原代培养；（3）皮肤成纤维细胞与上皮细胞的分离与纯化。本发明专利技术经过一次原代培养同时获得了高活力的内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞株和表皮细胞株,为深入开展内蒙古白绒山羊转基因研究、分子生物学及细胞生物学的相关研究提供了试验材料与技术支持。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于细胞培养
，具体而言，涉及以取自活体内蒙古白绒山羊耳部皮肤组织块为材料，同时分离内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞和表皮细胞的原代培养方法。
技术介绍
内蒙古白绒山羊是经过长期自然选育形成的优良地方性绒肉兼用型品种，所产羊绒具有径细绒长、综合品质优良的特点。然而，由于近年来草场退化，种群数量增加，舍饲比例加大，导致内蒙古白绒山羊的产绒量降低。通过转基因技术导入促进毛囊发育和绒毛生长的功能基因，培育高产绒量新品系是解决这一问题的有效手段。在高产绒量转基因绒山羊新品系的研究中，构建功能基因的皮肤特异性表达载体是关键步骤之一，而实现功能基因在皮肤特异性表达的关键在于构建载体时在功能基因上游引入皮肤特异性表达的启动子元件，以驱动功能基因的表达。在实际操作中，选择的皮肤特异性 启动子的功能首先需得到验证，具体包括两个方面一方面是这个启动子在皮肤细胞中的有效性，即是否工作及工作效率如何；另一方面是启动子的特异性，即应该是只在皮肤细胞中表达，在其它细胞中不表达或表达微弱。要实现启动子功能的验证，唯一简单的办法是将含有皮肤特异性启动子的载体同时转染皮肤细胞和其它非细胞，进而检测其有效性和特异性。鉴于此，通过试验研究获得内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞株及表皮细胞株， 这显得尤为重要。细胞培养技术是生命科学研究领域的重要手段，细胞的生长需要一定的营养环境，包括温度、湿度、气体及培养液。用于维持细胞生长的营养基质称为培养液。目前商品化的细胞培养液较多，有MEM系列，DMEM，RPMI-1640系列，199系列等。迄今，在众多培养液中，哪种培养液可以用于绒山羊皮肤成纤维细胞及表皮细胞的培养尚未见报道。另外，通过一次原代培养同时获得绒山羊皮肤成纤维细胞株和表皮细胞株的方法亦在现有技术中未见报道。
技术实现思路
鉴于现有技术的不足，本专利技术的目的在于通过研究同时分离内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞和表皮细胞的原代培养方法，从而获得内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞株和表皮细胞株，为开展内蒙古白绒山羊分子生物学和细胞生物学的相关研究及转基因研究提供了试验材料。本专利技术的目的是这样实现的—种同时分离内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞和表皮细胞的原代培养方法，皮肤成纤维细胞株和表皮细胞株的构建包括以下步骤(I)采样从雄性成年内蒙古白绒山羊个体的耳尖部取皮肤组织，用含双抗的生理盐水冲洗，然后去除附着在皮肤上的脂肪和结缔组织基膜层，露出真皮层后，置于70-75% (v/v)酒精中浸泡约45-60s后，再用含双抗的PBS洗涤，置于含双抗的DMEM/F12培养液中， 剪碎；(2)内蒙古白绒山羊耳部皮肤组织原代培养将皮肤组织块均匀接种在培养瓶的瓶壁，加入含胎牛血清、表皮细胞生长因子和双抗的DMEM/F12培养液，拧紧瓶盖，以组织块在上、培养液在下的方式放入培养箱，静置3 4h后，轻轻将培养瓶翻转，使培养液浸没组织块，在培养箱内静置培养，每2-4d更换一次新鲜培养液，培养Il-17d后，得到皮肤成纤维细胞与上皮细胞的混合原代细胞培养物；(3)皮肤成纤维细胞与上皮细胞的分离与纯化将步骤(2)所得混合原代细胞培养物用PBS清洗，再用l-2mL含O. 25% (w/v)胰蛋白酶和O. 02%EDTA (w/v)的D-Hanks液消化，至大部分细胞回缩及有少量细胞漂起后，立即终止消化，用移液枪吹打使细胞悬浮， 吸取细胞悬液离心弃上清后，接种入新的培养瓶中，放入培养箱培养，通过2 3次选择传代，得纯化的皮肤成纤维细胞株；吸取所述细胞悬液后的培养瓶用PBS洗涤，加入含胎牛血清、表皮细胞生长因子和双抗的DMEM/F12培养液继续放入培养箱培养，待表皮细胞长满瓶底时，消化传代，通过2 3次选择传代，得纯化的表皮细胞株。本专利技术的目的还可以这样实现所述的双抗是终浓度为100IU/mL的青霉素和100IU/mL的链霉素。所述的PBS由8g/L氯化钠、O. 2g/L氯化钾、I. 44g/L磷酸氢二钠和O. 24g/L磷酸二氢钾组成，pH=7. 4。步骤(2)和(3)中所述含胎牛血清、表皮细胞生长因子和双抗的DMEM/F12培养液是含10% (v/v)胎牛血清、100IU/mL青霉素、100IU/mL链霉素及15ng/mL表皮细胞生长因子的DMEM/F12培养液。步骤(2)和(3)中所述培养箱为37°C、含5%C02，的饱和湿度空气的二氧化碳培养箱。与现有技术相比，本专利技术涉及的分离内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞和表皮细胞的原代培养方法具有以下优点和显著进步(I)本专利技术通过研究同时获得了内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞和表皮细胞的原代培养方法，进而获得了内蒙古白绒山羊的皮肤成纤维细胞株和表皮细胞株，为开展内蒙古白绒山羊转基因研究及分子生物学和细胞生物学的相关研究提供了试验材料。(2)本专利技术在进行组织块贴壁法原代培养时，根据上皮细胞与成纤维细胞对TE液 (含0. 25%胰蛋白酶和0. 02%EDTA的D-Hanks液)消化敏感性的不同及二者贴壁强度的差异， 将二者分离、纯化。具体而言，通过控制合适的消化时间使成纤维细胞脱壁，而上皮细胞因脱壁较慢仍贴在培养瓶壁上，分瓶培养后，只需经过几次传代就可以得到纯化的皮肤成纤维细胞(参见图2 )、表皮细胞(参见图3)，通过一次原代培养同时获得了高活力的内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞和表皮细胞两种细胞株。附图说明图I为本专利技术内蒙古白绒山羊耳尖皮肤组织经培养前消毒处理及剔毛处理后，采用组织块贴壁法进行原代培养，经8天培养组织块周围有成纤维细胞和表皮细胞长出，环绕于组织块周围；A为皮肤成纤维细胞，B为表皮细胞，C为皮肤组织块。图2为本专利技术原代培养的皮肤细胞经过3次传代以后得到的较纯的皮肤成纤维细胞，细胞呈梭型。图3为本专利技术原代培养的皮肤细胞经过3次传代以后得到的较纯的表皮细胞，细胞呈圆形。图4为本专利技术获得的皮肤成纤维细胞的染色体数量分析图，染色体数量为2n=60。图5为本专利技术获得的表皮细胞的染色体数量分析图，染色体数量为2n=60。图6为本专利技术获得的皮肤成纤维细胞的生长曲线图。图7为皮肤特异性表达载体pDsR-K14p转染本专利技术获得的皮肤成纤维细胞和胎儿成纤维细胞48小时红色荧光表达情况照片；A、B为胎儿成纤维细胞，C、D为皮肤成纤维细胞;A、C为光镜照片，B、D为荧光照片；皮肤成纤维细胞中红色荧光蛋白的表达量较胎儿成纤维细胞为多。图8 为表达载体 K 14p-VEGF-K 14PolyA-Loxp - pCDsR-Loxp 和 pDsRK14p 转染绒山羊胎儿成纤维细胞48h的VEGF表达实时定量PCR分析图，转染组细胞中VEGF表达量与对照组差别不大。图9 为表达载体 K 14p-VEGF-K 14PolyA-Loxp - pCDsR-Loxp 和 pDsR_K14p 转染绒山羊皮肤成纤维细胞48h的VEGF表达实时定量PCR分析图，转染组细胞中VEGF表达量与对照组差别较大。图10 为表达载体 K 14p-VEGF-K 14PolyA-Loxp - pCDsR-Loxp 和 pDsR_K14p 转染绒山羊皮肤成纤维细胞或胎儿成纤维细胞48h，转染细胞及对照组细胞中VEGF的表达量比较图；K14p-VEGF-K14PoIyA-Loxp - pCDs本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种同时分离内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞和表皮细胞的原代培养方法，其特征在于：皮肤成纤维细胞株和表皮细胞株的构建包括以下步骤：（1）采样:从雄性成年内蒙古白绒山羊个体的耳尖部取皮肤组织，用含双抗的生理盐水冲洗，然后去除附着在皮肤上的脂肪和结缔组织基膜层，露出真皮层后，置于70?75%酒精中浸泡约45?60s后，再用含双抗的PBS洗涤，置于含双抗的DMEM/F12培养液中，剪碎；（2）内蒙古白绒山羊耳部皮肤组织原代培养:将皮肤组织块均匀接种在培养瓶的瓶壁，加入含胎牛血清、表皮细胞生长因子和双抗的DMEM/F12培养液，拧紧瓶盖，以组织块在上、培养液在下的方式放入培养箱，静置3～4h后，轻轻将培养瓶翻转，使培养液浸没组织块，在培养箱内静置培养，每2?4d更换一次新鲜培养液，培养11?17d后，得到皮肤成纤维细胞与上皮细胞的混合原代细胞培养物；（3）皮肤成纤维细胞与上皮细胞的分离与纯化：将步骤（2）所得混合原代细胞培养物用PBS清洗，再用1?2mL含0.25%胰蛋白酶和0.02%EDTA的D?Hanks液消化，至大部分细胞回缩及有少量细胞漂起后，立即终止消化，用移液枪吹打使细胞悬浮，吸取细胞悬液离心弃上清后，接种入新的培养瓶中，放入培养箱培养，通过2～3次选择传代，得纯化的皮肤成纤维细胞株；吸取所述细胞悬液后的培养瓶用PBS洗涤，加入含胎牛血清、表皮细胞生长因子和双抗的DMEM/F12培养液继续放入培养箱培养，待表皮细胞长满瓶底时，消化传代，通过2～3次选择传代，得纯化的表皮细胞株。...
【技术特征摘要】
1.一种同时分离内蒙古白绒山羊皮肤成纤维细胞和表皮细胞的原代培养方法，其特征在于皮肤成纤维细胞株和表皮细胞株的构建包括以下步骤 (1)采样从雄性成年内蒙古白绒山羊个体的耳尖部取皮肤组织，用含双抗的生理盐水冲洗，然后去除附着在皮肤上的脂肪和结缔组织基膜层，露出真皮层后，置于70-75%酒精中浸泡约45-60s后，再用含双抗的PBS洗涤，置于含双抗的DMEM/F12培养液中，剪碎； (2)内蒙古白绒山羊耳部皮肤组织原代培养将皮肤组织块均匀接种在培养瓶的瓶壁，加入含胎牛血清、表皮细胞生长因子和双抗的DMEM/F12培养液，拧紧瓶盖，以组织块在上、培养液在下的方式放入培养箱，静置3 4h后，轻轻将培养瓶翻转，使培养液浸没组织块，在培养箱内静置培养，每2-4d更换一次新鲜培养液,培养ll-17d后,得到皮肤成纤维细胞与上皮细胞的混合原代细胞培养物； (3)皮肤成纤维细胞与上皮细胞的分离与纯化将步骤(2)所得混合原代细胞培养物用PBS清洗，再用l-2mL含O. 25%胰蛋白酶和O. 02%EDTA的D-Hanks液消化，至大部分细胞回缩及有少量细胞漂起后，立即终止消化，用移液枪吹打使细胞悬浮，吸取细胞悬液离心弃上清后，接种入新的培养瓶中，放入培养箱培养，通过2 3次选择传代，得纯化...
【专利技术属性】
技术研发人员：王志钢，刘东军，旭日干，
申请(专利权)人：内蒙古大学，
类型：发明
国别省市：
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