本发明专利技术公开了一种人胚胎干细胞定向分化为角膜内皮细胞的诱导方法：在小鼠胚胎成纤维细胞饲养层上培养人胚胎干细胞，分选状态良好的人胚胎干细胞克隆团，接种于经丝裂霉素C处理过的人角膜基质成纤维细胞层上，培养7天，人胚胎干细胞分化成菊形团，将菊形团从人角膜基质成纤维细胞层分离移至培养瓶内，采用神经嵴干细胞培养基继续培养7天，流式细胞仪分选出人神经嵴干细胞，加入培养瓶内，采用人角膜内皮细胞条件培养基置于37℃、5%CO2孵箱内孵育培养，隔天换液，培养10天左右，即得角膜内皮细胞，其增殖能力类似正常人角膜内皮细胞,体外最多能传1～2代，可以作为种子细胞用于组织工程角膜构建及移植。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种，以及利用该诱导方法得到的角膜内皮细胞作为种子细胞用于组织工程角膜构建及内皮移植的用途，属于组织工程及眼科领域。
技术介绍
角膜内皮细胞位于角膜最内层呈六边形结构单层排列，对于维持角膜透明及其正常生理功能具有十分重要的意义。人角膜内皮细胞缺乏增殖能力，受损后主要依赖损伤区周边细胞的扩展和移行进行修复，当细胞密度小于500-800个/mm2时则会引起角膜内皮功能失代偿，导致角膜持续水肿失去透明性，表现为大泡性角膜病变，患者视力受损并出现眼磨、畏光、流泪等不适症状。感染、炎症、外伤(机械伤、化学伤、产伤、激光射线等)、眼部手术(白内障手术，抗青光眼手术，及其他眼内操作如前房异物取出等)、遗传性疾病、代谢性疾 病等都可引起内皮细胞损伤，受损到一定程度导致大泡性角膜病变，此时恢复视力、改善症状的唯一有效途径是角膜移植。但是角膜供体来源匮乏是全世界面临的难题，极大地限制了角膜移植手术的开展，使众多角膜病患者不能得到及时医治，只能在痛苦中等待角膜材料，带来极大的社会负担。近年来，随着国家复明工程的推进以及各地区医疗水平的不断提高，白内障、抗青光眼等手术得以广泛开展，随之而来的术中内皮受损，术后内皮细胞功能失代偿问题日显严峻。因此，体外获得大量具有正常功能的人角膜内皮细胞用于临床替代病变受损的角膜内皮具有重要的临床实践意义。人们一直致力于探索体外大规模扩增人角膜内皮细胞的方法。早期研究人员利用血管内皮细胞替代人角膜内皮细胞，能够在一定时间内维持角膜透明性，但要长期保持角膜透明及其生物安全性需要进一步实验验证。随着研究深入，人们尝试诱导前体细胞或祖细胞向人角膜内皮样细胞分化，比如人脐静脉内皮细胞具有祖细胞特性，将其移植到眼内在角膜基质和房水微环境的诱导下，细胞形态发生内皮样变化，同时角膜水肿减轻，表明其具有一定的内皮泵功能。有报道利用共培养的方法将骨髓内皮祖细胞诱导分化为角膜内皮样细胞，诱导细胞移植后角膜部分恢复透明。此外，近年来多个实验室研究发现在角膜基质、周边部内皮、小梁网以及过渡区内存在角膜内皮前体细胞，如能将这些细胞分离提纯，将为角膜内皮细胞体外诱导提供新的细胞来源。虽然人们进行了大量实验研究，期望实现人角膜内皮细胞的体外大规模扩增，但目前人们仍未找到体外获取具有正常功能的人角膜内皮细胞的方法。追溯人体发育过程，所有的体细胞均来源于胚胎干细胞。1998年人们成功实现了胚胎干细胞的分离培养。胚胎干细胞作为全能干细胞具有强大自我更新能力和分化能力，理论上可以分化为所有类型的成体细胞。目前已有报道成功诱导人胚胎干细胞分化为神经嵴干细胞、间充质干细胞以及脂肪细胞、神经元细胞和成骨细胞等终末分化细胞。人胚胎发育过程中，角膜内皮细胞来源于神经嵴干细胞，目前人们原代培养鼠神经嵴干细胞通过一定诱导条件使其分化为鼠角膜内皮细胞。涉及到伦理学争议，我们尚无法通过原代培养的方法获取人神经嵴干细胞，从而阻碍了人角膜内皮细胞的诱导分化。因此，我们期望诱导人胚胎干细胞分化为人神经嵴干细胞。有研究表明，将人胚胎干细胞与胚胎鼠颅骨基质细胞(PA6)共培养，利用基质细胞的诱导活性成功诱导出人神经嵴干细胞；角膜基质细胞具有很强的增殖能力在体外可以大量扩增。
技术实现思路
针对上述现有技术，基于现有技术中的研究，本专利技术提供了一种。本专利技术利用人角膜基质细胞诱导人胚胎干细胞转化为神经嵴干细胞，从而避免了动物细胞成分的污染，提高了生物安全性；再将诱导分化得到的人神经嵴干细胞进一步诱导转变为人角膜内皮细胞。该过程模拟人角膜内皮细胞胚胎发育，诱导出的细胞理论上最接近正常人角膜内皮细胞。本专利技术还将诱导分化人胚胎干细胞获得的人角膜内皮细胞应用于角膜内皮功能失代偿动物模型，为进一步临床应用奠定了基础。本专利技术是通过以下技术方案实现的·一种，步骤如下(I)人角膜基质成纤维细胞的原代培养将不适合用于角膜移植的新鲜人角膜环浸于含100U/ml青霉素-100U/ml链霉素的平衡盐溶液冲洗消毒,置于倒置显微镜下,上皮刀刮除角膜上皮，显微镊子撕除后弹力层及内皮，剩余角膜基质用显微剪剪成ImmX Imm组织块，均匀贴壁于培养皿，待贴壁牢固后加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，置于37°C、5%C02孵箱内孵育培养，每3天更换一次培养基；培养7天发现部分基质细胞游出，10天左右，剔除组织块，继续培养7天，倒置显微镜下观察待细胞铺满培养皿底部70% 80%时I :2传代培养；传代培养至第四代，加入上述培养基及丝裂霉素C(加入后，丝裂霉素C的终浓度为10ug/ml，丝裂霉素C可随培养基一起加入，也可单独加入)，抑制2小时，获得人角膜基质成纤维细胞层；所述含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基是在普通的DMEM/F12培养基基础上添加胎牛血清制成的，添加后，胎牛血清占总液体量的10% (在本专利申请中，如无特别说明，溶液百分比均表示添加物在终溶液中的体积分数);(2)常规原代培养小鼠胚胎成纤维细胞，取其3 4代作为饲养层，采用人胚胎干细胞培养基常规培养人胚胎干细胞，机械法分选形态状态良好的人胚胎干细胞克隆团，按照8 12个克隆/cm2密度接种于步骤(I)制备的人角膜基质成纤维细胞层上，采用不含bFGF的人胚胎干细胞培养基(在不含bFGF的培养环境下，有利于人胚胎干细胞进一步分化)培养7天，人胚胎干细胞分化成菊形团，机械法将菊形团从人角膜基质成纤维细胞层分离移至lOug/ml纤维连接蛋白包被的培养瓶内，采用神经嵴干细胞培养基继续培养7天，流式细胞仪分选出P75(+)细胞(人神经嵴干细胞)；所述人胚胎干细胞培养基是在DMEM knock out基础培养基上添加以下物质制成的knock out血清替代物,巯基乙醇,谷氨酰胺，非必需氨基酸(购自美国Invitrogen公司，货号11140)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF);添加后，knock out血清替代物占总液体量的20% (体积分数)，巯基乙醇的浓度为0. ImM，谷氨酰胺的浓度为0. ImM，非必需氨基酸的浓度为0. ImM，碱性成纤维细胞生长因子的浓度为4ng/ml ；所述不含bFGF的人胚胎干细胞培养基是指未添加bFGF的人胚胎干细胞培养基(其它成分如上述);所述形态状态良好的人胚胎干细胞是指圆形或类圆形、边缘光滑、细胞排列紧密均质、未分化的人胚胎干细胞；所述神经嵴干细胞培养基是在DMEM/F12培养基上添加以下物质制成的B27，ITS, EGF, bFGF和NGF ;添加后各物质的终浓度分别为B27占总液体量的2%，ITS占总液体量的 l%，EGF20ng/ml，bF GF 10ng/ml, NGF 10ng/ml ；(3)人神经嵴干细胞诱导分化为人角膜内皮细胞将步骤(2)分选出的人神经嵴干细胞用人角膜内皮细胞条件培养基重悬，加入经10ug/ml层粘连蛋白/10ug/ml硫酸软骨素包被的培养瓶内，置于37°C、5%C02孵箱孵育培养，隔天更换人角膜内皮细胞条件培养基，倒置显微镜下观察细胞形态由梭形逐渐变为多边形，至10天左右细胞基本长满，互相间形成紧密连接呈多边形单层排列，体外光学显微镜观察、实时定量聚合酶链式反应、免疫荧光等证实诱导细胞具有与正常人角膜内皮细胞相似的形态和表型，诱导出本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种人胚胎干细胞定向分化为角膜内皮细胞的诱导方法，其特征在于：步骤如下：（1）人角膜基质成纤维细胞的原代培养：将新鲜人角膜环浸于含100U/ml青霉素?100U/ml链霉素的平衡盐溶液冲洗消毒，置于倒置显微镜下，上皮刀刮除角膜上皮，显微镊子撕除后弹力层及内皮，剩余角膜基质用显微剪剪成1mm×1mm组织块，均匀贴壁于培养皿，待贴壁牢固后加入含有10%胎牛血清的DMEM/F12培养基，置于37℃、5%CO2孵箱内孵育培养，每3天更换一次培养基；待细胞铺满培养皿底部70%～80%时1：2传代培养；传代培养至第四代，加入上述培养基及丝裂霉素C，抑制2小时，获得人角膜基质成纤维细胞层；（2）常规原代培养小鼠胚胎成纤维细胞，取其3～4代作为饲养层，采用人胚胎干细胞培养基常规培养人胚胎干细胞，机械法分选形态状态良好的人胚胎干细胞克隆团，按照8～12个克隆/cm2密度接种于步骤（1）制备的人角膜基质成纤维细胞层上，采用不含bFGF的人胚胎干细胞培养基培养7天，人胚胎干细胞分化成菊形团，机械法将菊形团从人角膜基质成纤维细胞层分离移至10ug/ml纤维连接蛋白包被的培养瓶内，采用神经嵴干细胞培养基继续培养7天，流式细胞仪分选出人神经嵴干细胞；（3）人神经嵴干细胞诱导分化为人角膜内皮细胞：将步骤（2）分选出的人神经嵴干细胞用人角膜内皮细胞条件培养基重悬，加入经10ug/ml层粘连蛋白/10ug/ml硫酸软骨素包被的培养瓶内，置于37℃、5%CO2孵箱孵育培养，隔天更换人角膜内皮细胞条件培养基，培养至细胞基本长满，互相间形成紧密连接呈多边形单层排列，即得人角膜内皮细胞。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：吴欣怡，张凯，陈红梅，
申请(专利权)人：山东大学，
类型：发明
国别省市：
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