一种抗SFTSV的人源抗体制造技术

本发明专利技术公开了一种抗SFTSV的人源抗体，该抗体的核苷酸序列，其中轻链核苷酸序列见SEQ?ID?NO.5，重链核苷酸序列见SEQ?ID?NO.6，本发明专利技术公开了制备上述抗体的方法。本发明专利技术的抗体特异性识别SFTSV病毒颗粒。利用该抗体与对SFTSV的中和作用，将其制成特异性抗体药物，从而可在临床上用于预防和治疗由SFTSV感染引起的疾病。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种抗体，具体而言涉及一种抗SFTSV的人源抗体。
技术介绍
2010年中国中东部部分地区，包括安徽、江苏、湖北、河南、山东等省先后暴发多起由蜱虫叮咬而致人死亡的公共卫生事件，造成社会恐慌，严重影响当地群众健康安全和经济发展。经包括国家和相关省疾控中心多家单位的联合攻关，查明引起该传染病的病原为一新型的出血热病毒，在分类学上属于布尼亚病毒科(Bunyaviridae),目前命名为发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(Severe Febrile and Thrombocytopenic Syndrome Virus,SFTSV)。随着全国监测力度的加强，目前在我国浙江也发现该病毒的存在。另外，中东阿联酋最近也有疑似该病例的报道；在美国密苏里州发现的一种被称为Heartland的病毒，其与SFTSV基因组的同源性很高，说明SFTSV或许呈现世界性分布，或者能被生物媒介携带快速传播。布尼亚病毒科现分为5个属,其中有4个属对人致病，分别为正布尼亚病毒属、汉坦病毒属、内罗病毒属和白蛉病毒属。该科成员大多由媒介生物，如蜱、螨、蚊、鼠等传播，引起地区或全球性流行。在我国主要有汉坦病毒(汉坦病毒属)和新疆出血热病毒(内罗病毒属)引起地方性流行，而新发现的SFTSV则为白蛉病毒属的新成员。SFTSV基因组由大(L)、中(M)、小(S)三个单股负链RNA片段组成，与布尼亚病毒科其他病毒相似，病毒基因组3'末端和5'末端序列互补，形成非共价闭环RNA。L片段编码由2084个氨基酸组成的RNA依赖的RNA聚合酶;M片段编码具有1073个氨基酸的膜蛋白前体，翻译后经宿主细胞内蛋白酶的修饰形成Gn和Ge两个糖蛋白；S片段属双义RNA，分别编码核衣壳蛋白NP和非结构蛋白NSs。该病毒引起人感染的典型症状为，病人起病急，高热伴全身乏力、头痛、肌肉关节酸痛，其典型临床特征为白细胞和血小板明显降低，转氨酶升高，血清乳酸脱氢酶明显升高，凝血酶原时间延长，钠、钾、氯等电解质偏低。病例大都生活于丘陵地区，首发病例多为有野外工作经历的中老年人，病死率较高(可高达30% )，死亡原因主要是多脏器功能衰竭。该病例多为散发，亦可引起家庭聚集性暴发，人传人现象严重 由于该病是一新发自然疫源性传染病，疫情不可能短期内消失；目前临床尚无有效治疗策略，无疫苗供应；该病临床始发症状与普通流感无异，且病人多集中在农村地区，交通不便，卫生医疗水平薄弱，等到确诊，病情大多发展到病毒血症、多脏器衰竭，此时临床只能采取对症治疗手段。而作为化学治疗的补充，由抗体介导的预防和治疗病毒感染的措施已显现良好的效果，其应用前景得到专家的认同。事实上，国内首个用于治疗汉坦病毒感染的抗体药物已完成III期临床试验，准备上市。抗体作为人体内一种最重要的抗病毒免疫介质，抗体分子可以通过阻断病毒颗粒与其受体的结合、激活巨噬细胞、NK细胞等杀伤细胞、激活补体等多种机制来杀伤、清除病毒颗粒及受感染细胞。抗体制剂不仅可以中和病人体内大量的病毒，降低荷载，转归病情，对病人的密切接触者，如陪护、医护人员进行紧急被动免疫，防止二代、三代感染者的出现。研究表明，临床上使用病毒特异性的康复人血浆，可有效中和病毒，防止病毒在体内各器官扩散，避免发生致死性的多脏器衰竭，对病人病程的转归也起了重要作用。但多抗血浆不仅来源有限，同时其临床应用也受到诸如难以质控、供受体血型不匹配、潜在的传染性因子等条件的限制。鼠源单抗制备简单，治疗机理明确，但是其异源性阻碍了在人体内的应用。而人源单克隆抗体可有效克服上述问题。本研究采用噬菌体展示抗体文库技术，以纯化的SFTSV病毒为靶标，筛选人源抗体单链抗体片段(single chain variable fragment, scFv),获得一株具有广谱中和活性的人源单克隆抗体分子，MAb4-5。应用分子生物学手段对该抗体片段进行全分子化基因构建，真核表达了 MAb4-5IgGl。进一步的研究表明，该抗体分子结合的抗原决定簇位于病毒颗粒外膜Gn糖蛋白N末端的一个结构域,该决定簇呈线性排列。另外,对MAb4-5中和机制的研究结果表明，该抗体通过阻碍病毒糖蛋白与其易感细胞膜上受体的结合而发挥作用。
技术实现思路
本专利技术采用噬菌体展示抗体文库技术，以纯化的发热伴血小板减少综合征布尼亚病毒(Severe Febrile and Thrombocytopenic Syndrome Virus, SFTSV)为祀标，筛选人源抗体单链抗体片段(single chain variable fragment, scFv),获得一株具有广谱中和活性的人源单克隆抗体分子，MAb4-5,并应用分子生物学手段对该抗体片段进行全分子化基因构建，真核表达了 MAb4-5 IgGl0进一步的研究表明，该抗体分子结合的抗原决定簇位于病毒颗粒外膜GTn糖蛋白N末端的一个结构域，该决定簇呈线性排列。另外，对MAb 4_5中和机制的研究结果表明，该抗体通过阻碍病毒糖蛋白与其易感细胞膜上受体的结合而发挥作用。本专利技术公开了一种抗SFTSV的人源单链抗体MAb4_5，所述单链抗体包括轻链和重链，其氨基酸可变区序列分别如序列表中SEQ ID N0U SEQ ID NO :2所示，其编码基因分别如序列表中SEQ ID NO :3、SEQ ID NO 4所示。本专利技术所述的单链抗体的轻链蛋白质分子可变区的互补决定区⑶R1、⑶R2、⑶R3的氨基酸序列，分别如序列表中SEQ ID N0:5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7所示。所述单链抗体的重链蛋白质分子可变区的互补决定区CDR1、CDR2、CDR3的氨基酸序列分别如序列表中 SEQ ID N0:8、SEQ ID N0:9、SEQ ID NO :10 所示。本专利技术还公开了上述单链抗体MAb4-5及其全分子抗体MAb4_5IgG的制备方法，主要包括如下I.抗SFTSV scFv人源抗体文库构建和筛选首先，获取5名SFTSV感染康复者的外周血(经专利申请者所在单位伦理委员会、及相关献血者书面同意)，分离外周淋巴细胞，抽提总RNA，使用oligo (dT)引物反转合成cDNA，PCR分别扩增抗体的重、轻链可变区基因Vh和\，连接成scFv后克隆入载体pComb3Xss,电转化大肠杆菌XLl-Blue。以纯化的SFTSV颗粒包板进行亲和筛库，经过3轮的筛选(吸附-洗脱-扩增)，将第3轮洗脱的重组噬菌体感染大肠杆菌XLl-Blue后铺板，随机挑取90个单菌落，制备重组噬菌体，用ELISA筛选SFTSV特异性噬菌体克隆，共获得14个阳性克隆，经测序、去除重复序列，共获得6个特异性抗体克隆，分别是4-5、A5、A9、Al I、B2和D6。2.中和实验对于上述的6个scFv片段在大肠杆菌中进行了表达、纯化，并用纯化的scFv片段做中和实验。将浓度为100 μ g/nL的scFv片段50 μ L与等体积的SFTSV毒株JS-2010-003 (含有100TCID50)混合，37°C作用Ih后，该混合物加入到培养有Vero细胞单层的96孔板中，于37°C、5% CO2的培养箱中培养6d，每天观察细胞病变(Cytopathic effect, CPE)。对于能抑制大于9本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗SFTSV的人源单克隆抗体或其片段，包括轻链CDR1?3和重链CDR1?3，其特征在于，所述轻链CDR1?3的氨基酸序列为：CDR1：如序列表中SEQ?ID?NO：5所示；CDR2：如序列表中SEQ?ID?NO：6所示；CDR3：如序列表中SEQ?ID?NO：7所示；所述重链CDR1?3的氨基酸序列为：CDR1：如序列表中SEQ?ID?NO：8所示；CDR2：如序列表中SEQ?ID?NO：9所示；CDR3：如序列表中SEQ?ID?NO：10所示。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：焦永军，张黎，曾晓燕，郭喜玲，史智扬，崔仑标，周明浩，
申请(专利权)人：江苏省疾病预防控制中心，
类型：发明
国别省市：