本发明专利技术涉及抗西尼罗河病毒的非结构蛋白1的抗体，所述的抗体分别是单克隆抗体1C16A24和单克隆抗体1E85A4，其中，所述的单克隆抗体1C16A24由保藏号为CCTCC-C201276的杂交瘤细胞株分泌，所述的单克隆抗体1E85A4由保藏号为CCTCC-C201275的杂交瘤细胞株分泌。本发明专利技术所述的单克隆抗体1C16A24和单克隆抗体1E85A4可组成采用双抗体夹心ELISA方法检测西尼罗河病毒NS1抗原的免疫诊断试剂盒，该试剂盒具有灵敏度高和特异性好的优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及引入外来遗传物质而修饰的细胞，具体涉及杂交瘤细胞株，该细胞株可分泌抗西尼罗河病毒的非结构蛋白I的抗体。
技术介绍
西尼罗河热和西尼罗河性脑炎是由西尼罗河病毒(West Nile virus, WNV)感染引起的，该病于1937年首次暴发于乌干达，随后迅速传播到非洲各地、欧亚和中东等地区，1999年，WNV首次登陆西半球，并迅速肆虐美国，是继炭疽事件之后，又一种导致全美恐慌的致病性微生物。目前，该病毒在全球范围内仍呈现继续扩散的趋势，加拿大和欧洲一些国家相继出现了人感染而死于西尼罗河脑炎的报道。虽然，迄今为止，中国尚未有发现WNV感染的临床病例，但中国南部的气候、地里环境复杂，含有多种传播WNV的蚊虫种类，具备有 WNV传播的条件，再者，随着国际交流的日益频繁，WNV传人中国境内的可能性越来越大。西尼罗河病毒属于黄病毒属，日本脑炎病毒(Japanese encephalitisvirus, JEV)群的成员之一，与日本脑炎病毒具有相近的免疫原性，其主要的传播媒介是蚊子。研究认为，WNV是目前发现宿主最多的虫媒病毒，至少能寄居于36种蚊子，而我国能传播WNV的蚊种就有11种。对我国而言，西尼罗病毒是一种全新的致病病毒，全民普遍易感，人群中又没有免疫屏障，其危险性之大。因此，提前做好防范及相应的技术储备为我国应对WNV的传人至关重要。至今，具有保护性的疫苗尚未研制成功，临床上对于西尼罗河性脑炎尚未有特异性的治疗药物。但实践表明早期采取对症治疗可以大大减少西尼罗河脑炎的发病率和死亡率，因此西尼罗河热的治疗很大程度上取决于早期感染的诊断。由于多数西尼罗河病毒感染者早期缺乏特异的临床表现，仅有发热、头痛、全身肌肉酸痛等呼吸道症状，难以和其它发热性疾病和脑炎相鉴别。因此，灵敏、特异的早期诊断技术，对早期发现传染源，及时阻断西尼罗河病毒的传播途径至关重要。目前，西尼罗河病毒的实验室诊断方法主要包括病毒分离、血清学检测和核酸检测。其中病毒分离是西尼罗河病毒感染诊断的金标准，但该方法费时而且对于实验室的条件要求很高，必须具备III级生物安全实验室才能进行WNV的培养。虽然病毒核酸的检测方法比传统的病毒分离法更灵敏、快速，但分子诊断操作相对繁琐，对技术水平要求较高，较易发生污染导致假阳性结果，同时由于毒株变异、潜在突变等序列改变也可能引起假阴性结果，再者，西尼罗河病毒感染患者出现病毒血症的时间特别短，血清中病毒核酸存在时间短暂，不利于病毒感染的早期诊断。抗体检测试剂目前已成为美国等国家主要诊断方法，但由于西尼罗河病毒与其它黄病毒特别是与日本脑炎病毒存在血清学交叉反应，特别是接种乙型脑炎病毒、黄热病毒疫苗的人群易发生抗体假阳性的反应结果，不能特异的诊断WNV的感染。因此，选择一个适合的靶抗原建立抗原诊断试剂盒，不仅能够达到早期特异诊断疾病的目的，同时也能避免核酸检测中检测时限短的问题。西尼罗河病毒的非结构蛋白I (nonstructural protein I, NSl)是一种相对保守的糖蛋白，分子量为48kDa,其抗原性很强，且研究发现在西尼罗河热患者的早期血中存在高浓度的NSl循环抗原，因此，检测急性期病人血清中的循环NSl抗原可用于早期诊断西尼罗河病毒感染。目前已报道的几种检测西尼罗河病毒NSl的抗原捕获ELISA法，如VecTest的抗原检测方法，能在15min内快速检测出WNV的感染，但该方法的敏感性不好；MacDonald等利用黄病毒的交叉抗体4G4作为包被和检测抗体建立双抗体夹心，该方法能灵敏的检测到病毒培养上清中NSl蛋白，其最大检测限为lng/ml,但该方法特异性不好,不能区分不同黄病毒的感染；Kyung Min Chung.等，用西尼罗河病毒NSl特异性单克隆抗体建立的双抗体夹心抗原检测方法，其敏感度、特异性和稳定性都有很多的提高。而我国目前尚未有任何WNV的抗原检测试剂的报道，因此，建立一种快速、可靠、标准化的实验室诊断西尼罗河病毒的早期抗原检测试剂已成我国预防和控制该疾病的重要手段。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是提供抗WNV-NSU S卩，西尼罗河病毒的非结构蛋白 I)的抗体，该抗体可作为西尼罗河病毒NSl抗原的免疫诊断试剂，且灵敏度高和特异性好。本专利技术解决上述问题的技术方案如下所述本专利技术所述的抗WNV-NSl的抗体分别是单克隆抗体1C16A24和单克隆抗体1E85A4，其中，单克隆抗体1C16A24是由保藏号为CCTCC-C201276的杂交瘤细胞株分泌的；单克隆抗体1E85A4是由保藏号为CCTCC-C201275的杂交瘤细胞株分泌的。分泌上述单克隆抗体1C16A24和单克隆抗体1E85A4的杂交瘤细胞株已于2012年06月23日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其中，分泌单克隆抗体1C16A24的杂交瘤细胞株的保藏号为CCTCC-C201276 ;分泌单克隆抗体1E85A4的杂交瘤细胞株的保藏号为CCTCC-C201275。上述单克隆抗体1C16A24和单克隆抗体1E85A4可作为西尼罗河病毒NSl抗原的免疫诊断试剂，所述试剂可组成采用双抗体夹心ELISA方法的检测WNV-NSl抗原的免疫诊断试剂盒，该试剂盒包括捕获抗体和检测抗体，其中，所述的捕获抗体为上述单克隆抗体1C16A24，所述的检测抗体为上述单克隆抗体1E85A4。上述免疫诊断试剂盒为常规的采用双抗体夹心ELISA方法的免疫诊断试剂盒，该试剂盒由用于包被上述捕获抗体的微孔反应板、样品处理液、标记有标记物的上述检测抗体、阳性对照、阴性对照、浓缩洗液、显色液和终止液组成。上述试剂盒中，所述的标记物可以是生物素、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、胶体金、荧光素等，优选生物素。当所述的检测抗体上结合的标记物为生物素时，所述试剂盒还含有标记有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶的亲和素。所述的亲和素能与生物素以I : 4的比例结合，起到放大检测信号的作用，进一步提闻检测的灵敏度。本专利技术所述的单克隆抗体1C16A24和单克隆抗体1E85A4分别是由两株能分泌抗西尼罗河病毒NSl蛋白的杂交瘤细胞株分泌的，因此能特异性结合西尼罗河病毒的NSl蛋白的不同位点，可以实现准确、快速地检测出西尼罗河病毒，而与其它黄病毒属成员，如登革病毒、乙型脑炎病毒、森林脑炎病毒和黄热病毒无交叉反应。更进一步地，由本专利技术所述的单克隆抗体1C16A24和单克隆抗体1E85A4所组成的免疫诊断试剂盒检测西尼罗河病毒NSl蛋白的灵敏度可达30pg/ml，检测西尼罗河病毒培养上清的最低滴度为61PFU/ml，而且快速、准确。附图说明图I是单抗1C16A24和单抗1E85A4免疫印迹图，是重组WNV NSl蛋白与单克隆抗体的反应，条带I为无关单抗，条带2为单抗1C16A24，条带3为单抗1E85A4，条带4为抗GST单抗。 图2是所述检测试剂盒检测西尼罗河病毒NSl蛋白的标准曲线图，其中为检测西尼罗河病毒NSl蛋白的曲线，■^为BSA对照。图3是所述检测试剂盒的特异性分析结果图。图4是所述检测试剂盒检测模拟WNV感染病人血清标本的结果图。图5是所述检测试剂盒检测病毒感染的动物血清标本的结果图。具体实施例方式例IA、抗WNV-NSl蛋白的单克隆抗体1C16A本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种抗WNV？NS1的单克隆抗体1C16A24，该单克隆抗体是由保藏号为CCTCC？C201276的杂交瘤细胞株分泌的。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：车小燕，丁细霞，秦成峰，
申请(专利权)人：南方医科大学珠江医院，中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所，
类型：发明
国别省市：
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