本发明专利技术提供了一种等温扩增检测猴痘病毒的试剂。它包括：（1）检测猴痘病毒的标准品，所述标准品为采用人工合成的基因片段，克隆入pGSI质粒，得到的重组质粒载体；所述基因片段的碱基序列如SEQ?ID?NO：1所示；（2）引物，包括外引物F3、外引物B3、内引物FIP、内引物BIP。本发明专利技术还提供了一种等温扩增检测猴痘病毒的方法，其利用上述试剂，可以快速准确地检测猴痘病毒。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及检测猴痘病毒的试剂及方法，尤其涉及利用等温扩增技术检测猴痘病毒的试剂和方法。
技术介绍
猴痘病毒是一种人畜共患病，多发于中非和西非，1958年首次发现于猴子体内，上世纪70年代首次发现于人类感染猴痘病毒，2003年曾在美国威斯康辛州爆发，造成82人感染。猴痘病毒为双链DNA病毒，与天花病毒同属痘病毒科，感染的症状与天花相似，如发热、头痛、淋巴结肿大、咳嗽和全身极度疼痛，俗称“猴天花”，为未输入我国的危险病毒之一，可通过直接接触患者或者被感染的动物，或通过患者的体液传播，毒力强的病毒株有可能致死。天花疫苗对猴痘病毒有一定的抵抗能力，目前30岁以下人群均未接种天花疫苗，一旦 猴痘病毒传入将造成极大的危害。因此建立快速的猴痘病毒检测方法具有重要的现实意义。环介导等温扩增技术是一种高效、特异且不需要特殊仪器的核酸检测手段，针对靶基因的6个特征区域设计4种引物，利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶在恒温条件下催化新链合成，从而使靶基因高效扩增。它的产物是由多重复靶序列的茎-环状DNA和花椰菜状DNA所组成的混合物，在琼脂糖凝胶电泳上会呈现出LAMP所特有的阶梯状条带。LAMP反应过程将产生大量的焦磷酸根离子，与镁离子结合生成白色的焦磷酸镁沉淀，可根据快速离心或者浊度变化，直观观察检测结果，在基层或者落后地区技术人员只需简单培训就可完成实验操作。
技术实现思路
本专利技术首先所要解决的技术问题是提供一种等温扩增检测猴痘病毒的试剂，可以用于快速准确地检测猴痘病毒。为此，本专利技术采用以下技术方案它包括(I)检测猴痘病毒的标准品，所述标准品为采用人工合成的基因片段，克隆入pGSI质粒，得到的重组质粒载体；所述基因片段的碱基序列为CCTCTCTCATTGATTTTTCGCGGGATACATCATCTATTATAGCATCAGCATCAGAATCTGTAGGCCGTGTATCAGCATCCATTGTCGTAGACCAACGAGGAGGAGTATCGTCGGAACTGTACACCATAGTACTACGTTGAAGATCATACAGAGCTTTATTAACTTCTCGCTTCTCCATATTAAGTTGTTTAGTTAGTTGTGCAGTAGCTCCTTAGTCCAATGTTTTTAATAACCGCACACAATCTCTGTGTCAGAACGCTCGTCAATATAGATCGTAGAAATTTTTTAGAGAGAACTAACACAACTAGCAATAAAACTGATCTTATTTTATCATTTTTTTATTCATCATCCTCTGGTGGTTCGTCGTTCCTATCGAATGTAGCTCTGATTAACCCGTCATCTATAGGTGATGCTGGTTCTGGAGATTCTGGAGGAGATGGATTATTAT，如序列表 SEQ NO: I 所示；(2)引物,其基因喊基序列外引物F3:5' -CATTGATTTTTCGCGGGATA-3'；外引物B3:5' -TCCATCTCCTCCAGAATCTCC-3'；内引物FIP :5' -GTTGGTCTACGACAATGGATGCTCATCAGAATCTGTAGGCCGTGT-3/ ；内引物BIP :5' -TCCTTAGTCCAATGTTTTTAATAACCGAAAAATTTCTACGATCTATATTGACGAG-3/ 。本专利技术另一个所要解决的技术问题是提供一种等温扩增检测猴痘病毒的方法，可以快速准确地检测猴痘病毒。为此，本专利技术采用以下技术方案 它的反应体系25 μ 1，包括10Xbuffer2. 5μ 1，引物混合物I μ 1，模板DNAl μ 1，8U BstDNA 聚合酶 O. 8μ 1，甜菜碱(8Μ) 2μ 1，dNTP(10mM)2y 1，MgSO4(IOOmM) I. 2μ I,I.25 μ I荧光染料20 X Eva Green，加入ddH20补足25 μ I ;反应体系中引物终浓度分别如下外引物F3和外引物Β3各40ρΜ,内引物FIP和内引物BIP各800ρΜ ；将上述反应体系在水浴箱上63 °C 90分钟，或者在荧光定量PCR仪上63 °C I分钟，90个循环，同时进行待测样本、阴性对照和阳性对照的扩增，其中阴性对照采用双蒸水，阳性对照采用权利要求I所述的检测猴痘病毒的标准品；反应结束后，取扩增产物观察电泳结果，阳性对照孔产生阶梯状的条带，阴性对照孔则没有条带产生，待测样本孔中如产生阶梯状条带则含有猴痘病毒，反之没有猴痘病毒；或者，反应结束后，反应管离心6000rpm，3分钟，观察结果，阳性对照管可见白色沉淀，阴性对照管没有产生沉淀，样本管中如产生白色沉淀则含有猴痘病毒，反之没有猴痘病毒；或者紫外灯下观察荧光强度的变化，阳性对照产生强烈绿色荧光，阴性对照荧光强度没有变化，样本管中如产生强烈绿色荧光则含有猴痘病毒，反之没有猴痘病毒。进一步地，本专利技术检测方法还可进行定量检测。待测样本被检测出阳性后，所述方法通过对比标准曲线来对待测样本进行猴痘病毒的浓度检测；所述浓度检测包括以下步骤将待测样本和稀释至不同浓度的权利要求I所述的检测猴痘病毒的标准品同时按权利要求2所述的反应体系，在荧光定量PCR仪上进行扩增，反应程序63°C I分钟，90个循环，读取荧光值，阴性对照采用灭菌双蒸水，反应结束后根据得到所述标准品的各个浓度的循环阈值C (t)，采用计算机自动绘制标准曲线；通过对比标准曲线来对待测样本进行猴痘病毒的浓度检测，将待测样本循环阈值C (t)与所述标准曲线对照，得到待测样本DNA中的靶基因片段拷贝浓度，按照所述拷贝浓度判断待测样本中猴痘病毒的浓度。本专利技术具有操作简便，高效、快速、特异的优点。制备的标准品特异性强，碱基差异稳定，使设计的引物只针对猴痘病毒及其亚种，而不会把其他痘病毒或其他物种扩增出来，纯度高，易保存。引物与整个genbank数据库进行BLAST检索，和其它物种的核酸序列无同源，保证了检测方法的特异性。该方法的建立，填补了猴痘病毒恒温核酸扩增检测方法的空白，对样本的检测只需I. 5小时左右即可完成，可快速筛查猴痘病毒，对口岸输入性疾病筛查具有重要意义，为防御疾病的传入做好技术支撑和战略储备，满足当前卫生检疫的需求。附图说明图I为实施例I将特异片段克隆入pGSI质粒后的图谱。图2为实施例I中将转入质粒的片段与特异序列测序的对比结果。图3为实施例2中在25μ I体系中加入不同Mg2+浓度扩增后的电泳结果，I 为 marker :DL2000, 2 为力口入 MgSO4O. 9 μ 1，3 为 MgSO4L 05 μ 1,4 % MgSO4L 20 μ 1，5 为MgSO4L 35μ 1,6 =MgSO4L 5 μ 1,7 :阴性对照。图4为实施例2中在不同的温度下扩增的电泳结果，I为marker:DL2000，2为61°C，3 为 62°C，4 为 63°C，5 为 64°C，6 为 65°C。图5为实施例2中不同浓度的标准品在荧光定量PCR仪上读取的实施曲线，I为2. 76X IO7, 2 为 2. 76X IO6, 3 ^ 2. 76X 105，4 为 2. 76X IO4, 5 为 2. 76X 103，6 为 2. 76X本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种等温扩增检测猴痘病毒的试剂，其特征在于，它包括：（1）检测猴痘病毒的标准品，所述标准品为采用人工合成的基因片段，克隆入pGSI质粒，得到的重组质粒载体；所述基因片段的碱基序列如SEQ？ID？NO：1所示；（2）引物，其基因碱基序列：外引物F3：5′？CATTGATTTTTCGCGGGATA？3′；外引物B3：5′？TCCATCTCCTCCAGAATCTCC？3′；内引物FIP：5′？GTTGGTCTACGACAATGGATGCTCATCAGAATCTGTAGGCCGTGT？3′；内引物BIP：5′？TCCTTAGTCCAATGTTTTTAATAACCGAAAAATTTCTACGATCTATATTGACGAG？3′。
【技术特征摘要】
1.ー种等温扩增检测猴痘病毒的试剂，其特征在于，它包括 (1)检测猴痘病毒的标准品，所述标准品为采用人工合成的基因片段，克隆入PGSI质粒，得到的重组质粒载体；所述基因片段的碱基序列如SEQ ID NO 1所示； (2)引物，其基因喊基序列 外引物 F3 :5' -CATTGATTTTTCGCGGGATA-3'；外引物 B3 :5' -TCCATCTCCTCCAGAATCTCC-3'； 内引物FIP 5' -GTTGGTCTACGACAATGGATGCTCATCAGAATCTGTAGGCCGTGT-3'； 内引物BIP 5' -TCCTTAGTCCAATGTTTTTAATAACCGAAAAATTTCTACGATCTATATTGACGAG-3'。2.ー种等温扩增检测猴痘病毒的方法，其特征在干 它的反应体系25μ 1，包括10Xbuffer2. 5μ 1，引物混合物I μ 1，模板DNAl μ 1，8UBstDNA 聚合酶 O. 8 μ 1，甜菜碱(8102レ 1，dNTP(10mM)2y 1，MgSO4 (IOOmM) I. 2 μ 1，I. 25 μ I荧光染料20XEva Green，_AddH20*i25yl ;反应体系中引物终浓度分别如下外引物F3和外引物B3各40pM,内引物FIP和内引物BIP各800pM ； 将上述反应体系在水浴箱上63 °C 90分钟，或者在荧光定量PCR仪上63 °C I分钟，9...
【专利技术属性】
技术研发人员：吕沁风，郑伟，吴忠华，徐琦，罗鹏，何蕾，
申请(专利权)人：浙江国际旅行卫生保健中心，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。