本发明专利技术提供一种结核分枝杆菌特异性标志物Rv3120的重组蛋白，其具有如SEQ?ID?NO:1所示的氨基酸序列。本发明专利技术还提供所述结核分枝杆菌Rv3120重组蛋白的编码核苷酸序列、所述重组蛋白的制备方法及其用途。本发明专利技术基于免疫组学的研究成果，首次报道了一种结核分枝杆菌免疫优势抗原Rv3120。用于结核病细胞免疫学诊断，具有较高的敏感性高，而且与传统皮试试验相比，具有更为快速和安全可靠的优点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药体外诊断试剂领域，特别涉及一种新型结核病免疫标志物Rv3120的重组蛋白、其制备方法及其在细胞免疫诊断中的应用。
技术介绍
结核病由病原体——结核分枝杆菌感染机体所致，至今仍为人类重要的传染病。快速、准确的诊断结核分枝杆菌(MTB)感染，对于结核病的控制具有重要意义。MTB感染的诊断方法有很多，目前临床最为常用的方法仍然依靠传统的痰涂片细菌学检查，但检出率低；MTB培养可做为结核病确诊的“金标准”，但其培养时间太长，一般4-6周，难以满足临床 需要；BaCteC技术虽缩短了培养时间，但费用较高，短时间内难以推广普及；X线和CT检查仅提供影像学可能性诊断；聚合酶链反应(PCR)技术及其它基因诊断方法作为临床诊断尚存在操作复杂，对技术和人员专业素质要求较高，且仍不能用于菌阴结核病的快速诊断。抗结核免疫主要是细胞免疫，包括致敏的T淋巴细胞和被激活的巨噬细胞。致敏的T淋巴细胞可直接杀死带有结核杆菌的靶细胞，同时对释放多种作用于世噬细胞的淋巴因子，使巨噬细胞聚集在病灶周围形成以单核细胞为主的增生性炎症。被激活的巨噬细胞极大地增强对结核杆菌的吞噬消化，抑制繁殖，阻止扩散，甚至销毁的能力，充分分挥细胞免疫的作用。目前广泛应用的结核病细胞免疫诊断技术仍依赖于皮试检测试剂一结核分枝杆菌纯蛋白衍生物(Pro)。然而pro存在与环境分枝杆菌以及BCG疫苗株的交叉反应，所以诊断价值偏低。因而发现新的结核病细胞免疫标志物，并建立新的结核病细胞免疫诊断方法是结核病诊断所亟需的。
技术实现思路
为克服现有技术中的上述问题，本专利技术的一个目的是提供一种结核分枝杆菌Rv3120重组蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示，通过使用pET32a质粒，在Rv3120该天然蛋白序列前面加了一段Trx · Taq和S · Taq融合标签及His · Tag纯化标签。所述Trx · Taq和S · Taq融合标签及His · Tag纯化标签的氨基酸序列由SEQ IDNO: I中从氨基末端第I至第153位氨基酸残基序列组成。SEQ IDNO: I中从氨基末端第154至第353位氨基酸残基序列组成天然Rv3120蛋白氨基酸序列。本专利技术的另一个目的是提供一种编码上述的Rv3120重组蛋白的核苷酸序列，其具有选自下列C)、d)或e)的核苷酸序列c) SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列；d)不同于SEQ ID NO: 2但编码的氨基酸序列与SEQ ID NO: 2所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；e)在严格杂交条件下与上述c)或d)中的序列杂交，并且编码具有所述Rv3120重组蛋白活性的核苷酸序列。本专利技术的另一个目的在于提供所述的结核分枝杆菌Rv3120重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤(I)制备结核分枝杆菌菌株基因组DNA ；(2)扩增 Rv3120 基因;(3)Rv3120基因插入表达质粒；(4)将构建的表达质粒转化入宿主细胞；(5)诱导表达蛋白Rv3120 ； (6)分离纯化诱导表达产物，得到Rv3120重组蛋白，其中，在制备结核分枝杆菌Rv3120基因中采用的引物为Rv3120_F和Rv3120_R，所述引物Rv3120-F的核苷酸序列如SEQ ID No:3所示，所述引物Rv3120_R的核苷酸序列如SEQ ID No:4 所示。本专利技术的另一目的在于提供所述结核分枝杆菌Rv3120重组蛋白在制备检测或诊断结核病的试剂中的应用。所述Rv3120重组蛋白的基因引物为Rv3120-F和Rv3120_R，所述Rv3120-F的核苷酸序列为如SEQ ID No:3所示，所述Rv3120_R的核苷酸序列为如SEQID No:4 所示。本专利技术的另一目的在于提供所述结核分枝杆菌Rv3120重组蛋白、其特异性抗体或其基因引物在制备结核病检测试剂盒中的应用。所述Rv3120重组蛋白的基因引物为Rv3120-F和Rv3120-R，所述Rv3120_F的核苷酸序列为如SEQ ID No: 3所示，所述Rv3120_R的核苷酸序列为如SEQ ID No:4所示。本专利技术的另一目的在于提供一种结核病检测试剂盒，其组分中的检测抗原是所述结核分枝杆菌Rv3120重组蛋白。本专利技术的目的是提供一种包含所述结核分枝杆菌Rv3120基因的重组质粒。本专利技术的另一个目的是提供一种新型结核诊断试剂，其含有所述结核分枝杆菌Rv3120重组蛋白。本专利技术的再一个目的是提供上述试剂的制备方法。本专利技术的一个方面，提供了一种包含所述结核分枝杆菌Rv3120基因的重组质粒，即将Rv3120基因序列插入商用表达质粒序列中。Rv3120基因NCBI登陆号为NC_000962. 2 ;蛋白号为CAB08377. I。本专利技术的“Rv3120基因序列”也包括对NC_000962. 2中一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与NC_000962. 2核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码相同的氨基酸序列。该术语还包括在中度严密条件下，更佳地在高度严密条件下与NC_000962. 2的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与NC_000962. 2的核苷酸序列同源性至少70%，更佳地至少90%的核苷酸序列。本专利技术的重组质粒，通常将Rv3120基因插入表达质粒的多克隆位点处得到。本专利技术的重组质粒在制备过程中，可选用本领域已知的各种载体，然后将编码本专利技术的核苷酸序列可操作性地连接于表达调控序列，从而形成蛋白表达载体。本专利技术中可采用的载体有pET32a等。本专利技术的一个实施例中，所用的质粒为pET32a。本专利技术的另一方面，提供了一种结核分枝杆菌相关重组蛋白，该蛋白是将插入Rv3120基因的重组表达质粒转入宿主细胞而得到的。用作检测试剂的Rv3120重组蛋白与NCBI上的CAB08377. I蛋白序列相比，加入了载体相关序列和纯化标签。例如，使用pET32a质粒时，蛋白序列前面加了 pET32a上的一段Trx · Taq和S · Taq融合标签和一段His Tag纯化标签。所用的宿主细胞应当与表达质粒相匹配。可使用原核细胞或者真核细胞等，例如常用的大肠杆菌(E. coli)。用于转化的宿主细胞可以是BL21 (DE3)或BL21 plysS (DE3)菌株等。本专利技术的一个实施例中所用的就是BL21 plysS (DE3)菌株。本专利技术的另一方面，提供了上述结核分枝杆菌相关蛋白的制备方法，包括以下步骤(I)结核分枝杆菌菌株基因组DNA的制备；(2) Rv3120 基因的扩增；(3)Rv3120基因插入表达质粒；(4)将构建的表达质粒转化入宿主细胞；(5)诱导表达蛋白Rv3120 ；(6)分离纯化诱导表达产物，得到Rv3120重组蛋白。上述制备方法中，各种实验参数均按常规操作选择，可视具体实验条件而定。本专利技术的Rv3120基因序列可以用PCR扩增法获得。可根据本专利技术所公开的相关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用本领域技术人员已知的常规方法所制备的基因组DNA为模板，扩增而得到相关序列。本专利技术中，重组蛋白所用的表达质粒可以是pET32a等。本专利技术的一个实施例中，重组蛋白Rv3120按如下方法得到设计引物(Rv3本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种结核分枝杆菌RV3120重组蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO: I所示，通过使用pET32a质粒,在Rv3120该天然蛋白序列前面加了一段Trx · Taq和S · Taq融合标签及His · Tag纯化标签。2.根据权利要求I所述的Rv3120重组蛋白，其特征在于，所述Trx· Taq和S · Taq融合标签及His · Tag纯化标签的氨基酸序列由SEQ ID NO: I中从氨基末端第I至第153位氨基酸残基序列组成。3.一种编码权利要求I或2的Rv3120重组蛋白的核苷酸序列，其特征在于具有选自下列C)、d)或e)的核苷酸序列c)SEQ ID N0:2所示的核苷酸序列； d)不同于SEQID NO: 2但编码的氨基酸序列与SEQ ID NO: 2所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列； e)在严格杂交条件下与上述c)或d)中的序列杂交，并且编码具有所述Rv3120重组蛋白活性的核苷酸序列。4.根据权利要求I或2所述的结核分枝杆菌Rv3120重组蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤 (1)制备结核分枝杆菌菌株基因组DNA； (2)扩增Rv3120基因； (3)Rv3120基因插入表达质粒； (4)将构建的表达质粒转化入宿主细胞； (5)诱导表达...
【专利技术属性】
技术研发人员：张舒林，孙战强，赵俊伟，余晓丽，王洪海，
申请(专利权)人：上海交通大学，
类型：发明
国别省市：
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。