本发明专利技术公开了一种检测基因突变的方法。本发明专利技术提供了一种DNA分子测序的方法，包括如下步骤：(1)得到目的待测双链DNA分子；(2)磷酸化；(3)在DNA聚合酶的作用下，单链DNA分子1的5’端区域与3’端区域通过与单链DNA片段丙的分子条码区域互补的核苷酸连接成环；(4)用核酸外切酶消化；(5)滚环复制；(6)粘末端补平；(7)用核酸外切酶消化；(8)超声破碎；(9)末端修复和缺口连接；(10)磷酸化；(11)第一次测序；(12)第二次测序，读取分子条码信息；(13)获得结果。本发明专利技术可用于病原微生物变异的高灵敏性检测和病原微生物混合感染的快速甄别。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及。
技术介绍
病原微生物的不断变异是造成病原微生物免疫逃逸和抗药性的根本原因，如能对重要病原微生物流行过程中基因组变异进行检控及时检测出抗原表位漂移及抗药性突变的出现，这对预测病原微生物流行趋势，及早采取相应的免疫措施或及时更换治疗药物具有重要的作用。尽管病原微生物变异及抗药性突变检测在疾病预防和治疗中 都具有极高的应用价值，但因缺乏高效、低廉能克服基因组高背景的检测方法，使其难以应用到临床实践中。Sanger测序法虽一直是突变检测广泛应用的平台，但其灵敏度较低，PCR产物混合测序时只能检测到> 20%的突变，单个克隆测序又费力耗时。另外，在病原微生物混合感染中病原微生物的分离和鉴定也是临床实践中遇到的一大难题。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供。本专利技术提供了一种DNA分子测序的方法，包括如下步骤(I)以来自一个待测样本的双链DNA分子为模板，用单链DNA片段甲和单链DNA片段乙组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物，得到目的待测双链DNA分子(目的待测双链DNA分子即目的基因片段或带有样品条码的目的基因片段)；所述目的待测双链DNA分子由单链DNA分子I和单链DNA分子2组成，且单链DNA分子I和单链DNA分子2反向互补；所述单链DNA片段甲为所述单链DNA分子I的5’端区域；所述单链DNA乙包括所述单链DNA分子2的5’端区域；(2)将步骤(I)的PCR扩增产物进行磷酸化；(3)将步骤(2)的产物单链化并与单链DNA片段丙及dNTP共孵育，所述单链DNA分子I的5’端区域与所述单链DNA片段丙的3’端区域配对形成双链，所述单链DNA分子I的3’端区域与所述单链DNA片段丙的5’端区域配对形成双链；在DNA聚合酶的作用下，所述单链DNA分子I的5’端区域与3’端区域通过与所述单链DNA片段丙的分子条码区域互补的核苷酸连接成环；所述单链DNA片段丙自5’末端至3’末端依次包括三个区域所述单链DNA分子2的5’端区域、分子条码区域和所述单链DNA分子2的3’端区域；所述分子条码区域由选自A、T、C和G的10至16个核苷酸组成；(4)将步骤(3)的产物用核酸外切酶进行消化，去除没有成环的单链DNA分子；(5)以步骤(4)的产物为模板进行滚环复制；(6)将步骤(5)的产物的粘末端补平；(7)将步骤(6)的产物用核酸外切酶进行消化，去除单链DNA分子；(8)将步骤(7)的产物进行超声破碎并回收与待测双链DNA分子大小近似的片段；(9)将步骤(8)回收的片段进行末端修复和缺口连接；(10)将步骤(9)的产物进行磷酸化；(11)将步骤(10)的产物进行第一次测序；(12)完成步骤(11)后，以所述单链DNA片段甲为测序引物进行第二次测序，读取分子条码信息；(13)将具有相同分子条码的测序结果进行拼接，每种分子条码获得一个具体的测序结果。 所述单链DNA片段乙可为所述单链DNA分子2的5’端区域；所述单链DNA片段丙可由所述单链DNA分子2的5’端区域、所述分子条码区域和所述单链DNA分子2的3’端区域组成。所述待测样本为两种以上时，采用相应数量的样品条码分别进行标记；所述样品条码由选自A、T、C和G的6个核苷酸组成；所述单链DNA乙的5’端还具有所述样品条码区域；所述单链DNA片段丙中，在所述单链DNA分子2的5’端区域和所述分子条码区域之间，还具有与所述样品条码区域反向互补的DNA区域；所述方法中，将每种所述待测样本分别进行所述步骤(I)，混合后进行所述步骤(2)。所述单链DNA片段乙可由所述单链DNA分子2的5’端区域和所述样品条码区域组成；所述单链DNA片段丙可由所述单链DNA分子2的5’端区域、与所述样品条码区域反向互补的DNA区域、所述分子条码区域和所述单链DNA分子2的3’端区域组成。以上任一所述方法均可用于检测基因变异。所述方法用于检测单个样本中的目的基因变异时，将所述方法得到的各个测序结果分别与目的基因的现有序列进行比对，从而判断目的基因发生的突变；所述来自一个待测样本的双链DNA分子为来自一个待测样本的基因组DNA或cDNA。所述方法用于检测多个样本中的目的基因变异时，将所述方法得到的各个测序结果分别与目的基因的现有序列进行比对，从而判断目的基因发生的突变；所述来自一个待测样本的双链DNA分子为来自一个待测样本的基因组DNA或cDNA。所述目的待测双链DNA分子可为500_1000bp。所述步骤(8)中，所述与待测双链DNA分子大小近似的片段具体可为500-1000bp的片段。所述以来自一个待测样本的双链DNA分子具体可为来自293T细胞的cDNA。所述目的待测双链DNA分子具体可为序列表的序列I所示的双链DNA分子。所述步骤(8)中，所述与待测双链DNA分子大小近似的片段具体可为600-1000bp的片段。本专利技术克服了新一代测序平台读出序列较短的不足，提供了一种能将同一分子不同短序列拼装在一起的方法。本专利技术的特征是通过高通量测序，在单分子水平上进行基因变异的检测，且可在同一基因上检出多点突变。本专利技术可用于病原微生物变异的高灵敏性检测和病原微生物混合感染的快速甄别。附图说明图I为两轮测序的流程示意图。具体实施例方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。293T细胞(ATCC CRL-11268) 0实施例中均采用Nano-100_微量分光光度计测定DNA含量。实施例1、293T细胞中Bcr-Abl基因变异的检测一、制备 cDNAI、提取293T细胞的总RNA。2、以步骤I提取的总RNA为模板，采用NEB公司的逆转录试剂盒制备cDNA(双链)。二、目的片段高保真扩增I、以步骤一得到的cDNA为模板，用单链DNA片段甲和单链DNA片段乙组成的引物对，在Phusion DNA聚合酶(NEB公司的一种高保真DNA聚合酶)的作用下进行PCR扩增，得到PCR扩增产物。使用ZYMO公司的DNA纯化试剂盒纯化回收PCR扩增产物。单链DNA 片段甲5’ -AGGGAGGGTGTACCATTACAGGA-3’ ；单链DNA 片段乙5’ -TTCTCCCCTACCAGGCAGTTTC-3’。PCR扩增的反应体系为50ul，其中含有Iul双链cDNA、2. 5ul DNA片段甲(IOuM)、2.5ul DNA 片段乙(IOuM)和 Iul dNTP (each IOmM)。PCR扩增的反应条件98°C 30s,98°C 10s、66°C 10s、72°C 30s，15 个循环(10-20 个循环均可)；72°C 7min ;10°C保存。 2、取步骤I得到的PCR扩增产物(约300ng)，使用NEB的T4DNA磷酸化酶进行磷酸化(采用50ul体系)，然后采用ZYMO公司的DNA纯化试剂盒纯化回收。3、取步骤 2 的产物(约 IOOng)、10ul 单链 DNA 片段丙 IulUOXAmpligasebuffer2ul，用紫外线处理后的ddH20定容至18ul ;然后依次进行如下处理(使双本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
2011.03.17 CN 201110063911.51.一种DNA分子测序的方法，包括如下步骤 (1)以来自一个待测样本的双链DNA分子为模板，用单链DNA片段甲和单链DNA片段乙组成的引物对进行PCR扩增，回收PCR扩增产物，得到目的待测双链DNA分子；所述目的待测双链DNA分子由单链DNA分子I和单链DNA分子2组成，且单链DNA分子I和单链DNA分子2反向互补；所述单链DNA片段甲为所述单链DNA分子I的5’端区域；所述单链DNA乙包括所述单链DNA分子2的5’端区域； (2)将步骤(I)的PCR扩增产物进行磷酸化； (3)将步骤(2)的产物单链化并与单链DNA片段丙及dNTP共孵育，所述单链DNA分子I的5’端区域与所述单链DNA片段丙的3’端区域配对形成双链，所述单链DNA分子I的3’端区域与所述单链DNA片段丙的5’端区域配对形成双链；在DNA聚合酶的作用下，所述单链DNA分子I的5’端区域与3’端区域通过与所述单链DNA片段丙的分子条码区域互补的核苷酸连接成环；所述单链DNA片段丙自5’末端至3’末端依次包括三个区域所述单链DNA分子2的5’端区域、分子条码区域和所述单链DNA分子2的3’端区域；所述分子条码区域由选自A、T、C和G的10至16个核苷酸组成； (4)将步骤(3)的产物用核酸外切酶进行消化，去除没有成环的单链DNA分子； (5)以步骤(4)的产物为模板进行滚环复制； (6)将步骤(5)的产物的粘末端补平； (7)将步骤(6)的产物用核酸外切酶进行消化，去除单链DNA分子； (8)将步骤(7)的产物进行超声破碎并回收与待测双链DNA分子大小近似的片段； (9)将步骤(8)回收的片段进行末端修复和缺口连接； (10)将步骤(9)的产物进行磷酸化； (11)将步骤(10)的产物进行第一次测序； ...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨怀义，朱鈞，倪挺，刘翟，
申请(专利权)人：中国科学院微生物研究所，
类型：发明
国别省市：
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