本发明专利技术涉及微生物学技术和分子生物学技术交叉领域，具体的说一种基于属特异性引物-PCR结合链霉素抗性平板特异性分离鞘氨醇单胞菌的方法及其专用引物。具体为，将待测样品悬液涂布含链霉素的LB培养基固体平板，挑取黄色菌落反复划线分纯，经液体培养后，提取纯菌株基因组DNA，采用鞘氨醇单胞菌属特异性引物PCR扩增16SrDNA片段，存在阳性扩增且扩增得到504bpPCR产物的片段即为鞘氨醇单胞菌。采用本发明专利技术提供的属特异性引物扩增结合链霉素抗性平板法能够特异性的从土壤中直接分离可培养的鞘氨醇单胞菌，针对这一特殊种属进行计数，同时获得可培养的鞘氨醇单胞菌菌株资源。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及微生物学技术和分子生物学技术交叉领域，具体的说ー种基于属特异性引物-PCR结合链霉素抗性平板特异性分离鞘氨醇单胞菌的方法。
技术介绍
鞘氨醇单胞菌从属于a-变形菌纲，鞘氨醇单胞菌目，鞘氨醇单胞菌科，由于其具有某些生理特征(如含大质粒、可降解多环芳烃类化合物、产生黄色素等)以前曾被归于假单胞菌属(Pseudomoans)或黄杆菌属(Flavobacterium)。1990年，日本学者Yabuuchi等通过研究16SrRNA的核苷酸序列、胞内脂质中出现的特殊鞘糖脂和辅酶Q的主要类型，首次提出这是ー个新的细菌属-鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)。该属的菌株均为革兰氏阴性菌，无孢子，以单侧生极性鞭毛运动，多呈黄色，专性需氧且能产生过氧化氢酶。其细胞膜组成不同于一般的革兰氏阴性好氧菌特有的脂多糖，而是糖鞘脂，这是所有鞘氨醇单胞菌都具有的重要特征。近年来，大量的鞘氨醇单胞菌已经陆续从环境中被分离出来，而且大多数是从多氯联苯、杂酚油、五氯苯酚、除草剂、多环芳烃(PAHs)等污染环境中发现的。这些分离自污染环境的鞘氨醇单胞菌几乎都具有降解污染物的能力，表明鞘氨醇单胞菌是ー类具有代谢多样性的微生物资源，暗示了其在生物修复方面的潜在重要性。此外，由于其能够耐受极端贫营养条件，并产生有价值的高分子聚合物，该属逐渐成为环境微生物领域关注的ー个热点研究对象。目前，还没有一种选择性培养基能够针对鞘氨醇单胞菌进行专ー培养，因此目前所获得的可培养鞘氨醇单胞菌资源大多是通过从环境样品中分离某种特定功能菌株，然后经生理生化特性鉴定，确认其为鞘氨醇单胞菌，这使得鞘氨醇单胞菌的发现和分离具有偶然性和随机性，大大降低了挖掘这一特定种属菌株资源的几率。目前，还没有ー种能够从环境样品中特异性快速直接分离可培养鞘氨醇单胞菌的方法。目前，国内尚未有其他学者以16SrDNA为研究対象，针对鞘氨醇单胞菌这一特定种属进行研究。国外有少数报道曾尝试设计鞘氨醇单胞菌16S rDNA属特异性引物或探针，包括简并引物或非简并引物，但所设计的引物检测特异性差，即除了能扩增鞘氨醇单胞菌夕卜，还能扩增其它属的菌株；或检测谱小，不能扩增绝大多数的鞘氨醇单胞菌属菌株。因此，目前还没有一对合适的非简并引物能够特异性扩增鞘氨醇单胞菌16SrDNA。
技术实现思路
本专利技术目的在于提供一种基于属特异性引物-PCR结合链霉素抗性平板特异性分离鞘氨醇单胞菌的方法。为实现上述目的，本专利技术采用的技术方案为一种基于属特异性引物-PCR结合链霉素抗性平板特异性分离鞘氨醇单胞菌的专用引物，鞘氨醇单胞菌属特异性引物Sph-429f和Sph-933r为Sph_429f 5’ -TAAAGCTCTTTTACCCG-3’ ；Sph_933r5’ -AAACCACATGCTCCACC-3J 一种基于属特异性引物-PCR结合链霉素抗性平板特异性分离鞘氨醇单胞菌的方法，将待测样品悬液涂布含链霉素的LB培养基固体平板，挑取黄色菌落反复划线分纯，经液体培养后，提取纯菌株基因组DNA，采用鞘氨醇单胞菌属特异性引物PCR扩增16SrDNA片段，存在阳性扩增且扩增得到504bpPCR产物的片段即为鞘氨醇单胞菌；鞘氨醇单胞菌属特异性引物PCRph-429f和Sph-933r为Sph_429f 5’ -TAAAGCTCTTTTACCCG-3’ ；Sph-933r :5’ -AAACCACATGCTCCACC-3J 具体为I)制备土壤样品微生物细胞悬液称取5g待测土样加入45mL生理盐水并添加玻璃珠，于150rpm振荡2h ;而后将悬浮液静置，取上清液，用生理盐水对土壌悬液进行10倍梯度稀释；2)涂布链霉素抗性LB固体平板取0. Iml步骤I)中稀释度为KT2-KT6的土壤悬液涂布至添加链霉素的LB固体培养基平板上，以30°C倒置培养4天；3)划线分纯挑取LB链霉素抗性平板上生长的黄色菌落，在LB链霉素抗性平板上反复划线分纯，直至分离出单菌落；4)提取纯菌株基因组DNA :将步骤3)中分纯后的菌落接种LB液体培养基，30°C摇床过夜培养；而后采用试剂SDS、蛋白酶K和CTAB/NaCl提取基因组DNA ；5)属特异性引物扩增纯菌株16SrDNA片段以Sph_429f和Sph_933r作为鞘氨醇单胞菌属16SrDNA特异性引物，模板为步骤4)中提取的基因组DNA进行PCR扩增，PCR反应产物用I. 5%琼脂糖凝胶电泳检测，得到阳性PCR产物且片段大小为504bp的菌株，即为鞘氨醇单胞菌；Sph-429f :5’ -TAAAGCTCTTTTACCCG-3，；Sph_933r :5’ -AAACCACATGCTCCACC-3，。所述LB液体培养基配方为胰蛋白胨IOg,酵母浸粉5g,NaClIOg,用蒸懼水定容至1000ml, pH7. 2-7. 4 ；LB固体培养基配方为在LB液体培养基中加入2%重量的琼脂粉；链霉素抗性LB固体培养基配方为在LB固体培养基中加入50 u gmじ1预先用0. 22 y m滤膜过滤除囷的链霉素。所述步骤5)PCR扩增PCR反应体系组成如下lylDNA模板，10XPCR反应缓冲液 5 ii I，2. 5mmol/LdNTP 混合溶液 4 y I，20pmol/L 弓 I 物 Sph_429f I u I，20pmol/L 弓 I 物Sph-933rliil，Taq酶(5U/u 1)0. 25 yl，加灭菌去离子水至总体积为50 yl ;PCR反应条件94°C预变性5min，94°C变性lmin，55°C退火45s，72°C延伸90s，35个循环，最后72°C延伸8min。所述步骤4)提取纯菌株基因组DNA:将3)中分纯后的菌落接种LB液体培养基，30°C 150rpm摇床过夜培养，8000rpm离心2min收集菌体，加入597 u ITE缓冲液重悬菌体，并加入30 ill 10%的SDS和3 ill ZOmgmr1的蛋白酶K于37 °C温浴Ih ;然后加入IOOu 15mol F1NaCl和80 yl 10%十六烷基三甲基溴化铵/氯化钠(十六烷基三甲基溴化铵/氯化钠为4. IgNaCl溶解于80ml H2O,缓慢加入lOgCTAB，加水至100ml)混匀，65°C温浴lOmin。水浴后加入800 yl的酚-氯仿-异戊醇混合液(酚-氯仿-异戊醇按体积比24 I I混合)混合均匀，6000Xg离心IOmin收集上清，上清液中再加入与上清液等体积的氯仿-异戊醇混合液(氯仿-异戊醇按体积比24 I混合)混合均匀，6000 Xg离心IOmin收集上清。上清液中再加入上清液0. 8倍体积的异丙醇室温静置lh，12000Xg离心20min离心收集DNA沉淀。本专利技术的有益效果如下I.本专利技术结合了传统选择性培养基培养和分子生物学技术，提供链霉素抗性平板培养结合属特异性引物-PCR的方法，从环境样品中特异性分离鞘氨醇单胞菌，克服了以往获得鞘氨醇单胞菌菌株资源的偶然性和随机性。2.采用本专利技术提供的属特异性引物-PCR结合链霉素抗性平板的方法，可以直接从土壤样品中快速分离可培养鞘氨醇单胞菌菌株资源，并在此基础上研究这些菌株的功能，有望获得携帯特定功能基因(例如有机污染物降解、高分子物质本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
1.一种基于属特异性引物-PCR结合链霉素抗性平板特异性分离鞘氨醇单胞菌的专用引物，其特征在于鞘氨醇单胞菌属特异性引物Sph-429f和Sph-933r为Sph_429f 5’ -TAAAGCTCTTTTACCCG-3’ ；Sph-933r :5’ -AAACCACATGCTCCACC-3’。2.—种权利要求I所述的基于属特异性引物-PCR结合链霉素抗性平板特异性分离鞘氨醇单胞菌的方法，其特征在于将待测样品悬液涂布含链霉素的LB培养基固体平板，挑取黄色菌落反复划线分纯，经液体培养后，提取纯菌株基因组DNA，采用鞘氨醇单胞菌属特异性引物PCR扩增16SrDNA片段，存在阳性扩增且扩增得到504bpPCR产物的片段即为鞘氨醇单胞菌； 鞘氨醇单胞菌属特异性引物Sph-429f和Sph-933r为Sph_429f :5’ -TAAAGCTCTTTTACCCG-3’ ；Sph-933r :5’ -AAACCACATGCTCCACC-3’。3.按权利要求2所述的基于属特异性引物-PCR结合链霉素抗性平板特异性分离鞘氨醇单胞菌的方法，其特征在于 1)制备样品土壤微生物细胞悬液称取5g待测土样加入45mL生理盐水并添加玻璃珠，于150rpm振荡2h ;而后将悬浮液静置，取上清液，用生理盐水对土壌悬液进行10倍梯度稀释； 2)涂布链霉素抗性LB固体平板取0.Iml步骤I)中稀释度为10_2-10_6的土壌悬液涂布至添加链霉素的LB固体培养基平板上，以30°C倒置培养4天； 3)划线分纯挑取LB链霉素抗性平板上生长的黄色菌落，在LB链霉素抗性平板上反复划线分纯，直至分离出单菌落； 4)提取纯菌株基因组DNA:将步骤3)中分纯后的菌落接种LB液体培养基，30°C摇床过夜培养；而后采用试剂SDS、蛋白酶K和CTAB/NaCl提取基因组DNA ； 5)属特异性引物扩增纯菌株16SrDNA片段以Sph_429f和Sph_933r作为鞘氨醇单胞菌属16SrDNA特异性...
【专利技术属性】
技术研发人员：李慧，周丽莎，张颖，徐慧，韩斯琴，史荣久，杨伟超，
申请(专利权)人：中国科学院沈阳应用生态研究所，
类型：发明
国别省市：
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