核酸探针检测方法及其试剂盒技术

本发明专利技术所要解决的问题在于提供一种具有更高灵敏度和信噪比的基于石墨烯的核酸探针检测方法及其试剂盒和应用。将氧化石墨烯与荧光基团标记的核酸探针、待检测、鉴定和/或定量的样品进行混合，最后检测分离产物的荧光量。氧化石墨烯的易合成和探针DNA的单标记特点使得该探针成为低成本、快速检测方法的首选之一。由于石墨烯表面积大以及其良好的淬灭效果，该探针能同时检测多个不同待检测物质并且比传统的分子信标能提高至少一个数量级。不会出现适配体与靶分子（MAMmRNA）和其他非特异核酸序列互相干扰的情况。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于核酸检测方法
，具体涉及核酸探针检测方法及其试剂盒。
技术介绍
生物分子检测在分子诊断、工业和环境监测以及生化防御等领域得到广泛应用。随着应用的进一步发展，开发快速、简单和低成本的生物传感器显得非常重要。纳米材料由于其独特的光学、电学以及催化特性，能很好的解决其中部分问题。特别是近些年，很多 研究人员把目光投向基于纳米材料的生物传感器，这些生物传感器利用了不同组分、尺寸、相貌的纳米材料与生物分子间的相互作用。最具代表的是美国西北大学的Mirkin教授组开发的一系列基于纳米金的高灵敏度的生物传感器(N. L. Rosi, C. A. Mirkin, Chem.Rev. 2005，105，1547.)。核酸探针是以病原微生物DNA或RNA的特异性片段为模板，人工合成的带有放射性或生物素标记的单链DNA片段，可用来快速检测病原体。核酸探针将一段已知序列的多聚核苷酸用同位素、生物素或荧光染料等标记后制成的探针。可与固定在硝酸纤维素膜的DNA或RNA进行互补结合，经放射自显影或其他检测手段就可以判定膜上是否有同源的核酸分子存在。利用荧光标记的DNA探针均能检测核酸，具有一些内在的优点，如操作方便、具有很快的杂交动力学以及能够和实时定量PCR或者原位细胞成像兼容。一般此类探针都由荧光基团和淬灭基团组成，基于能量共振转移原理。随着DNA杂交发生，荧光基团和淬灭基团距离发生改变，导致荧光变化。近些年，为了增加此类探针的信噪比，传统的有机荧光 基团和淬灭基团被量子点、纳米金和单壁碳纳米管取代。石墨烯(graphene)是由单层碳原子构成的二维纳米材料,该材料具有独特的电学、热学和力学性质，并且氧化之后的石墨烯具有很好的水溶性，因此该材料在纳米电子学和纳米复合材料领域应用非常广泛。石墨烯和石墨一样属于复式六角晶格，在二维平面上每个碳原子以sp2杂化轨道相衔接，也就是每个碳原子与最近邻的三个碳原子间形成三个O键。剩余的一个P电子轨道垂直于石墨烯平面，与周围原子形成键，碳原子间相互围成正六边形平面蜂窝形结构，这样在同一原子面上只有两种空间位置相异的原子。最近，一些研究人员通过理论模拟发现，石墨烯具有长程纳米尺度上的能量转移特性，因此可以作为一种超强淬灭剂(R. S. Swathi, K. L. Sebastian, J. Chem. Phys.2008， 129， 054703)。
技术实现思路
本专利技术所要解决的问题在于提供一种具有更高灵敏度和信噪比的基于石墨烯的核酸探针检测方法。本专利技术的所要解决的又一问题，在于提供上述的核酸探针检测试剂盒。本专利技术的所要解决的又一问题，在于提供上述的核酸探针检测试剂盒的应用。为了解决现有技术中的这些问题，本专利技术第一方面提供的技术方案是核酸探针检测方法，其特征在于，包括以下步骤， (1)氧化石墨烯的制备， (2)准备荧光基团标记的核酸探针，及准备待检测、鉴定和/或定量的样品， (3)将步骤(I)中的氧化石墨烯与步骤(2)中的荧光基团标记的核酸探针、待检测、鉴定和/或定量的样品进行混合， (4)将上述的混合产物进行分离，检测分离产物的荧光量。优选地，所述步骤(3)中，氧化石墨烯和荧光基团标记的核酸探针进行混合，然后加入待检测、鉴定和/或定量的样品。优选地，步骤(3)中反应的温度为20°C -37 °C，混合时间为1—30分钟。 优选地，步骤(3)中反应的温度为37 °C，混合时间为I分钟。优选地，所述的氧化石墨烯为片层结构，每片面积大小在300-500平方纳米范围内，片层厚度在0. 5 2nm范围内。优选地，所述的荧光基团标记的核酸探针为荧光标记的适配体。优选地，所述的荧光基团为FAM或ROX或CY5。优选地，反应体系为pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液，其具体配方为100 mM NaCl, 7.7mM Na2HPO4, 2. 3 mM NaH2PO4。为了解决现有技术中的这些问题，本专利技术第二方面提供的技术方案是一种核酸探针检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括荧光基团标记的核酸探针、氧化石墨烯。优选地，所述的氧化石墨烯为片层结构，每片面积大小在300-500平方纳米范围内，片层厚度在0. 5 2nm范围内。优选地，所述的荧光基团标记的核酸探针为荧光标记的适配体。优选地，试剂盒中采用pH 7. 4的磷酸盐缓冲溶液，其具体配方为100 mM NaCl,7.7 mM Na2HPO4, 2. 3 mM NaH2PO4。优选地，荧光标记的适配体可以根据具体的检测需要而选用相应的适配体，且当适配体种类为一种以上，其上各自的荧光基团的激发和发射波长不能有重叠。为了解决现有技术中的这些问题，本专利技术第三方面提供的技术方案是前述的试剂盒在制备用于核酸探针检测方法的制品中的应用。在本文中，术语“氧化石墨烯”具有本领域技术人员所熟知的含义，本专利技术的石墨烯(Graphene)是纳米石墨烯纳米材料。氧化石墨烯(Graphene oxide, GO)具有与突光基团进行能量共振转移，从而猝灭荧光的特性。GO与单链核酸之间存在较强的作用，荧光基团标记的单链核酸被吸附到GO表面，则荧光基团靠近GO表面，被激发的能量转移到GO表面，则检测不到荧光。而GO对核酸双链的作用很弱，双链DNA远离G0，荧光基团标记的核酸则在相应波长激发下发出荧光。探针是以病原微生物DNA或RNA的特异性片段为模板，人工合成的带有放射性或生物素标记的单链DNA片段，可用来快速检测病原体。核酸探针将一段已知序列的多聚核苷酸用同位素、生物素或荧光染料等标记后制成的探针。可与DNA或RNA进行互补结合，经放射自显影或其他检测手段就可以判定是否有同源的核酸分子存在。本专利申请中的术语“适配体”是本领域技术人员所熟知的，指的是能够与特定的靶分子结合的单链核酸，包括DNA或RNA。本专利技术使用的核酸适配体5’端修饰有不同的荧光基团。本专利技术中，适配体aptamer链用不同的突光基团标记， 氧化石墨烯(GO)和DNA之间的相互作用，当存在待检测的DNA时，荧光基团标记的互补DNA与靶DNA相互杂交，由于GO对双链的作用很弱，双链DNA远离G0，荧光基团在相应波长激发下发出荧光。而没有靶DNA时，由于GO与单链DNA之间存在较强的作用，荧光基团标记的DNA被吸附到GO表面，荧光基团靠近GO表面，被激发的能量转移到GO表面，没有荧光。通过荧光的数值我们可以判断靶DNA的存在。本专利技术旨在建立一种用于DNA检测的探针，该探针利用了 DNA/G0之间的相互作用。同时，该策略不限于DNA的检测，还可以检测腺嘌呤和重金属离子等。 本专利申请中的术语“荧光基团”是本领域技术人员所熟知的，如常用的FAM、R0X、CY5。修饰好的荧光基团的核酸适配体可以从生物公司购买，但在荧光基团的选择上要求各个核酸适配体荧光基团的激发和发射波长不能有重叠，因此也不宜采用磷光基团。相对于现有技术中的方案，本专利技术的优点是 I.氧化石墨烯的易合成和探针DNA的单标记特点使得该探针能够成为低成本、快速检测方法的首选之一。整个检测过程耗时短，无需复杂仪器及特别技巧，尤其是该方法可以利用未经精度提纯的待测样品直接检测这样极大地方便了检测操作，节省了试剂使用并加快了检测进程。相对较高本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
1.一种核酸探针检测方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤 (1)氧化石墨烯的制备， (2)准备荧光基团标记的核酸探针，及准备待检测、鉴定和/或定量的样品， (3)将步骤(I)中的氧化石墨烯与步骤(2)中的荧光基团标记的核酸探针、待检测、鉴定和/或定量的样品进行混合； (4)将上述的混合产物进行分离，检测分离产物的荧光量。2.根据权利要求I所述的核酸探针检测方法，其特征在于，所述步骤(3)中，氧化石墨烯和荧光基团标记的核酸探针进行混合，然后加入待检测、鉴定和/或定量的样品。3.根据权利要求2所述的核酸探针检测方法，其特征在于，步骤(3)中反应的温度为.20 0C -37 °C，混合时间为1—30分钟。4.根据权利要求2所述的核酸探针检测方法，其特征在于，步骤(3)中反应的温度为37°C，混合时间为I分钟。5.根据权利要求I所述的核酸探针检测方法，其特征在于，所述的氧化石墨烯为片层结构，每片面积大小在300-500平方纳米范围内，片层厚度在0. 5 2nm范围内。6.根据权利要求I所述的核酸探针检测方法，其特征在于，所述的荧光基团标记的核...

【专利技术属性】
技术研发人员：樊春海，宋世平，黄庆，
申请(专利权)人：华森新科苏州纳米技术有限公司，
类型：发明
国别省市：