一种用于非病毒基因载体材料的功能性寡聚物，由MA-His-OMe和MAEL通过以水溶性硫代酯作为分子量调节剂自由基聚合制得；其制备方法是以MA-His-OMe和MAEL为共单体，以AIBN)或ACVA为引发剂，以CPADB为连转移剂制备；将该功能性寡聚物与聚阳离子材料混合制备DNA或RNA复合物，用作非病毒基因载体材料，并进行细胞转染试验。本发明专利技术的优点：该功能性寡聚物对质粒DNA具有良好保护作用，改善了复合粒子与细胞膜表面的结合作用以及质粒DNA在细胞之内从溶酶体/内涵体中的逃离效率，从而使复合粒子对HeLa等细胞的转染效率大幅提高，毒性大幅下降，有望达到临床应用水平。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于基因治疗及新材料领域，具体涉及一种用于非病毒基因载体材料的功能性寡聚物及应用。
技术介绍
基因治疗是一种利用分子生物学方法将目的基因导入患者体内，使之表达目的基因产物，从而使疾病得到治疗的技术。基因载体是基因治疗领域的核心技术之一。基因载体通常分为病毒载体和非病毒载体.在多数情况下，病毒载体的转染效率高，但存在潜在毒性、免疫原性等问题，限制了其在临床治疗中的应用；非病毒载体虽然可以克服上述问题， 但是不利的生物分布以及低效的胞内运转，导致活性基因转染率低.因此提高非病毒基因载体的转染率是当前研究的关键。阳离子聚合物，如壳聚糖、聚赖氨酸、聚乙烯亚胺、聚甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵等是最为常用的几种非病毒基因载体聚合物材料。这些聚合物材料作为基因载体材料的主要问题是，其与DNA或RNA形成的复合物粒子易在生理环境下对一些蛋白质产生特异性的相互作用而产生吸附，从而影响其细胞内吞作用以及从内涵体或溶酶体中逃逸的速度继而影响转染效率。克服该问题的办法主要通过化学改性的方式，如通过化学修饰方法在其结构中引入PEG链段，但是该方式往往同时也消耗了聚阳离子结构中的氨基，使其压缩 DNA的能力下降。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对上述存在问题，提供一种用于非病毒基因载体材料的功能性寡聚物及应用，该功能性寡聚物制备工艺简单、易于实施；该功能性寡聚物与其它聚阳离子材料一起用作非病毒基因载体，具有低细胞毒性、良好的抗血清稳定性和高的基因转染效率，有望用于临床基因治疗。本专利技术的技术方案一种用于非病毒基因载体材料的功能性寡聚物P(His-C0-DMAEL)，由烯丙基组氨酸衍生物，2-甲基丙烯酰胺基-3-(4-咪唑基)丙酸甲酯(MA-His-OMe)和含乳糖单体2-氧-甲基-丙烯酰氧乙氧基-O，3，4，6-四-氧-乙酰基-β-D-半乳糖)-(1-4)-2，3， 6-三-氧-乙酰基-β -D-吡喃葡糖糖苷(MAEL)通过以水溶性硫代酯作为分子量调节剂自由基聚合制得，分子量为0. 5-20KDa，分子量分布为1. 0-2. 0，MA-His-OMe和MAEL摩尔比为3-15 1。一种所述用于非病毒基因载体材料的功能性寡聚物的制备方法，以MA-His-OMe 和MAEL为共单体，以2，2'-偶氮二 O-甲基丙腈)(AIBN)或4，4'-偶氮(4-氰基戊酸) (ACVA)为引发剂，以4-氰基戊酸-二硫代苯酯(CPADB)为连转移剂制备，步骤如下1)以组氨酸甲酯和烯丙基苯并三氮唑为原料合成2-甲基丙烯酰胺基-3-(4-咪唑基)丙酸甲酯(MA-His-OMe)将4. 8g苯并三氮唑溶解在25ml 二氯甲烷中，加入1. 2g 二氯亚砜，搅拌30min后， 加入0. 86g甲基丙烯酸，继续反应池，有机相用浓度为2摩尔/升的氢氧化钠溶液萃取三次，有机相用硫酸钠干燥12h，旋蒸除去二氯甲烷，产物用快速层析柱纯化，得到烯丙基苯并三氮唑。将1. 87g烯丙基苯并三氮唑溶解在50ml 二氧六环中；将1. 69g组氨酸甲酯溶解在 IOml去离子水中，磁力搅拌条件下，调节其pH值为8. 0，然后将溶解在二氧六环中的烯丙基苯并三氮唑缓慢滴加至上述组氨酸甲酯溶液中进行反应，并用薄层色谱监测反应进程，待薄层色谱显示烯丙基苯并三氮唑消耗完全时，停止搅拌，用质量百分比浓度为10%的稀盐酸调节溶液PH值至中性，旋蒸除去二氧六环，过滤除去不溶物并旋蒸除去水相，产物经冷冻干燥后溶解在无水乙醇中并过滤，再将滤液旋干并真空干燥，得到MA-His-OMe ；2)2-氧-甲基-丙烯酰氧乙氧基，3，4，6_四-氧-乙酰基-β _D_半乳糖)-(1-4)-2，3，6-三-氧-乙酰基-β-D-吡喃葡糖糖苷(MAEL)的制备将20g乳糖、IOg无水醋酸钠加到120ml醋酸酐中，混合并在回流温度下反应2h， 反应结束后将产物倒入冰水中搅拌，过滤并用水洗涤固体三次，置于空气中干燥，然后用乙醇重结晶得到八乙酰基乳糖；在20ml 二氯甲烷中，加入5g八酰基乳糖和4. 8ml甲基丙烯酸羟乙酯以及2mL三氟化硼-乙醚，在冰水浴中反应池，然后室温反应12h，反应结束后加入 20ml去离子水，分离后依次用水、饱和碳酸氢钠溶液和水洗涤二氯甲烷相至中性，然后用硫酸钠干燥，旋蒸除去二氯甲烷并用色谱柱分离，得到MAEL ；3)用于非病毒基因载体材料的功能性寡聚物的制备0. 96g MA-His-OMe、0· 5g MAEL、0. 0075g ACVA 和 0. 023g CPADB 溶解在 IOml N,N' -二甲基甲酰胺中，冷冻除氧三次后密封置于70°C水浴中反应48小时，反应结束后， 先用截留分子量为3500的透析袋在去离子水中透析48h并冷冻干燥，然后将产物溶解在无水乙醇中，加入Iml质量百分比浓度为30%甲醇钠的甲醇溶液并反应2小时，再用截留分子量为3500的透析袋在去离子水透析48小时并冷冻干燥，得到功能性寡聚物 P(His-co-DMAEL)。一种所述用于非病毒基因载体材料的功能性寡聚物的应用，将该功能性寡聚物与聚阳离子材料混合制备DNA或RNA复合物，用作非病毒基因载体材料，并进行细胞转染试验。所述聚阳离子材料包括壳聚糖(以下简称为CS)、聚赖氨酸(PLL)、聚乙烯亚胺 (PEI)和聚甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵(PDMMC)。所述DNA或RNA复合物的制备方法是，先将0. 1-2. 0 μ g/μ 1的功能性寡聚物与 DNA或RNA室温下混合均勻并放置15分钟；然后再将0. 1-2. 0 μ g/ μ 1的聚阳离子材料溶液滴加入上述DNA混合液中，振动搅拌10秒使溶液混合均勻并放置15分钟，即可制得Ν/Ρ =0.25 1-40 1 比的 DNA 或 RNA 复合物。所述功能性寡聚物与DNA或RNA的质量比为0-200 1。所述功能性寡聚物与聚阳离子材料的质量比为0-40 1。本专利技术的主要优点一些常用的聚阳离子材料单独作为基因载体材料时，往往或因毒性大或转染效率低而，难以临床应用。本专利技术的方法通过引入一种多功能性的非离子寡聚物，既得到了对质粒DNA具有良好保护作用、稳定性高的复合纳米粒子，同时又改善了复合粒子与细胞膜表面的结合作用以及质粒DNA在细胞之内从溶酶体/内涵体中的逃离效率，从而使复合粒子对HeLa、H印G2、NIH3T3等细胞的转染效率较未改性聚赖氨酸、壳聚糖、聚乙烯亚胺、聚甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵等聚阳离子大幅提高，有望达到临床应用水平，同时经本专利技术方法改性的聚合物较未改性聚合物在细胞毒性方面也大幅下降。附图说明图1为聚400Μ核磁谱图。图2为不同聚阳离子与DNA形成的复合物在相同Ν/Ρ比时的体外细胞转染绿色荧光图以及相对应的明场图。图3为相同聚阳离子与DNA形成的复合物在不同Ν/Ρ比时的体外细胞转染绿色荧光图以及相对应的明场图。图 4 为不同 P (His-co-DMAEL)含量的 PLL/DNA/P (His-co-DMAEL)复合物在相同 N/ P比时的体外细胞转染绿色荧光图以及相对应的明场图。图 5 为 PLL/DNA、PLL/DNA/P (His-co-DMAEL)复合物在 0. 5%牛血清白蛋白(BSA) 溶液中粒径随时间的变化图，复合物D本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：郭天瑛，周德重，李从欣，胡玉玲，
申请(专利权)人：南开大学，
类型：发明
国别省市：
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