本发明专利技术提供了可用在DNA测序技术和其它类型的DNA分析中的本文所述的新的核苷酸、核苷及其衍生物。在一个实施方案中，具有未保护的3’-OH的核苷酸或核苷在核碱基上被衍生成包括通过连接物与不可断裂的终止基团连接的荧光染料。所述不可断裂的荧光基团被设计成终止DNA合成，使得可以平行模式对DNA寡聚体进行有效测序。在另一个实施方案中，具有未保护的3’-OH的核苷酸或核苷在核碱基上被衍生成包括通过连接物与光可断裂的终止基团连接的荧光染料。所述光可断裂的荧光基团被设计成终止DNA合成以及被断裂，使得可以平行模式对DNA寡聚体进行有效测序。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术一般涉及用于DNA测序和其它类型DNA分析的化合物和方法。更具体而言， 本专利技术涉及利用光可断裂基团标记的核苷酸和核苷、利用不可断裂基团标记的核苷酸和核苷以及其在DNA测序和分析中的使用方法。
技术介绍
快速DNA测序方法已经成为分析种群中疾病和突变以及开发治疗方法的需求。最常观察到的人序列变异形式是单核苷酸多态性(SNP)，其以大约1/300至1/1000个基因组序列碱基对而存在。基于人基因组全序列，正在努力通过绘制SNP谱或直接关联来确认成为常见疾病原因的基因关联。基于快速、高通量和低成本的DNA测序技术的开发将促进对遗传信息(例如SNP)在应用医学中的理解和应用。一般而言，10% -15%的SNP将通过改变特定氨基酸残基来影响蛋白质功能、通过改变剪切机制来影响对基因的适当加工、或者通过改变调节机制来影响基因或蛋白质的正常表达水平。设想信息性SNP的鉴定将导致对遗传病的更准确诊断、对风险易感性的更好预测、或对组织中偶发性突变的识别。个体SNP特性的一个应用将是利用预防性药物治疗来显著延迟疾病的发生或进展。此外，药物代谢基因的SNP特性可用于制定具体的给药方案以提供更安全和更有效的结果。为实现这些宏大的目标，基因组测序将进入具有对大多数种群进行部分测序可能性的重测序(resequencing)阶段，其将涉及对特定区域或分布在整个人类基因组中的单碱基对进行平行测序以获得特定复杂疾病的SNP特性。成为大多数常见疾病原因的序列变异很可能与分散在全部相关基因中并以低频率存在的多个SNP有关。因此，与仅靶向已知SNP的技术相比，利用从头测序策略的DNA测序技术更可能检测和/或发现这些少见的、广泛分布的变异体。传统上，通过“Sanger”法或“双脱氧”法实现DNA测序，其包括通过利用DNA聚合酶引入2，，3，-双脱氧核苷酸(ddNTP)的DNA合成的链终止(Sanger, F.，Nicklen, S.，and Coulson, A. R. (1977)DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 5463-5467) 所述反应还包括天然2，-脱氧核苷酸(dNTP)，其通过DNA 合成扩增DNA链。链扩增与链终止之间的大体平衡的竞争导致形成一系列套式DNA(nested DNA)片段，其均勻地分布在数以千计的碱基中并且在碱基对增长尺寸方面不同。利用电泳根据套式DNA片段的各自尺寸对其进行拆分。测序反应中的dNTP/ddNTP比决定链终止的频率，并因此决定终止链的长度分布。然后，当利用合适的激光源照射时，通过之前的4种不同荧光团与4种DNA碱基(即A、C、G和T)的结合发出其各自颜色的荧光来检测所述片段。目前，Srnger 测序通过直接 PCR 测序(Gibbs，R. Α·，Nguyen，P. -N.，McBride，LJ.， Koepf, S. M.，and Caskey, C. Τ. (1989) Identification of mutations leading to the Lesch-Nyhan syndrome by automated direct DNA sequencing of in vitro amplified cDNA. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86，1919-1923)或基因组测序(Hunkapiller，Τ.，Kaiser, R. J.，Koop，B. F.，and Hood, L. (1991) Large-scale and automated DNA sequencing Determination.Science 254，59—67 ；International Human Genome Sequencing Consortium. Initial sequencing and analysis of the human genome. (2001)Nature 409,860-921)已经成为用于发现SNP的最广泛应用的方法。另一种具有前景的测序方法是周期可逆终止(CRT)，其为一种测多模板的同步单个碱基加成的周期性方法。该方法本身与Sanger法(Metzker，M.L. (2005)Genome Rex 15， 1767-1776)的不同之处在于其可不需要凝胶电泳(其为推进该领域的主要瓶颈)而进行。 然而，与Sanger测序相似，读取长度较长意味着需要较少次测序试验来覆盖整个基因组。仍然难于实现长CRT读取的目标，因为利用可商购的DNA聚合酶，可逆的终止子通常起到弱底物的作用。利用3’-0_阻滞基团和通过连接基团与荧光染料结合的核碱基构成可逆的终止子。在随后的碱基加成之前，阻滞基团和染色基团均需要除去。这些核苷酸修饰不能良好地耐受DNA聚合酶，这可通过多种策略进行突变来提高酶性能。脱保护时，将核碱基连接物置于一边，随着其后的CRT循环，在生长中的DNA双螺旋中进行依次累积。据信弱的酶动力学和随后修饰的DNA双螺旋限制了较长的读取长度。本专利技术部分地描述了需要终止部分和荧光染色部分的单一结合来提高酶动力学和脱保护效率的新的可逆核苷酸结构。 这些可逆终止子通过多种可商购的DNA聚合酶而被有效地引入，所述生长中的DNA双螺旋通过脱保护步骤转变为其天然状态。CRT技术的DNA测序读取长度由每个核苷酸加成循环的总效率所决定。例如，如果认为50%原始材料的终点具有可接受的信噪比，那么下述等式可用于评价循环效率对读取长度的作用(RL广eff = 0.5，其中RL是碱基的读取长度，CefT是总循环效率。换句话说，可以通过90%的总循环效率实现7个碱基的读取长度，通过99%的循环效率实现70个碱基的读取长度，可通过99. 9%循环效率实现700个碱基的读取长度。为实现对大长度测序的目标，所述方法必须提供非常高的循环效率或者所述恢复可降至可接受的信噪比以下。表现出较高引入效率和脱保护效率的可逆终止子将实现较高的循环效率，因而实现较大的读取长度。为使CRT终止子适当地起作用，必须在温和条件下有效地断裂掉所述保护基。保护基的除去通常涉及利用强酸或强碱、催化或化学还原的处理，或者这些方法的组合。这些条件对于所述DNA聚合酶、核苷酸、寡核苷酸引物模板、或固体载体而言可能是反应活性的，产生不希望的结果。使用光化学保护基是一种有吸引力的替代强烈化学处理的方法，并且可以非侵入方式进行使用。已有多种光可除去的保护基(例如2-硝基苄基、苄氧基羰基、3-硝基苯基、苯甲酰甲基、3，5-二甲氧基苯偶姻基(3，5-dimeth0Xybenz0inyl)、2，4-二硝基苯硫基及其各自的衍生物)被用于合成肽、多糖和核苷酸(Pillai，V. N. R. (1980)Photoremovable Protecting Groups in Organic Synthesis. Synthesis, 1-26)。在这些保护基中，光敏感的2-硝基苄基保护基已成功用于以下的基团用于二核糖核苷合成的核糖核苷的2' -0H(0htsuka, Ε.，Tanaka, 本文档来自技高网...
【技术保护点】
【技术特征摘要】
...
【专利技术属性】
技术研发人员：弗拉迪斯拉夫·A·利托什，布赖恩·P·斯图皮，迈克尔·L·梅茨克，吴卫东，
申请(专利权)人：激光基因公司，
类型：发明
国别省市：
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