核酸纯化方法技术

本发明专利技术涉及一种从包含核酸的样本中纯化定量的核酸的方法，该方法具有至少以下步骤：a.将包含核酸的样本与定量的核酸结合相接触，该核酸结合相具有以下特征：(i)核酸结合相具有核酸结合配体，该配体具有至少一个可质子化的基团；(ii)核酸结合配体结合于到载体；(iii)核酸结合相具有低电荷密度的表面，其中，样本中核酸的量超过所使用数量的核酸结合相的结合能力；b.在低于至少一个可质子化的基团的pKs值的pH(结合pH)条件下，核酸结合于核酸结合相；c.在高于结合pH的pH条件下，洗脱核酸，从而得到定量的核酸。本发明专利技术还涉及可以用于核酸的纯化的相应的试剂盒和核酸结合相。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】核酸纯化方法本专利技术涉及从包含核酸的样本中纯化定量的核酸的方法。此外，提供相配的试剂盒及核酸结合相，试剂盒及核酸结合相使得定量的核酸从样本中分离，所以适合使洗脱液中的核酸浓度标准化。现有技术已知各种不同的用于纯化和分离核酸的方法。这些方法包括使用苯酚-氯仿，盐析技术，使用离子交换剂和氧化硅颗粒。一种已知的核酸纯化方法是所谓的“电荷-转换(charge-switch)方法”。依照该方法，在第一pH值下引入核酸结合相，与包含核酸的样本接触，其中核酸结合相具有正电荷。这促进带有负电荷的核酸与相结合。为了核酸的释放/洗脱，根据电荷-转换(charge-switch)原理，为了转换(也就是中和)正电荷，建立高于核酸结合相的pKs值的第二pH。这促进了结合的核酸从核酸结合相分离。对于许多分析技术和生物学方法来说，需要使用一定的，也就是说定量的核酸。从不同的原材料(样本)中分离或扩增的核酸的量取决于一些难以控制的因素，以致产量可以根据方法和材料大大地改变。为了随后的使用分离的核酸的实验在可比较的条件下实施，作为一个原则，需要对获得的核酸定量，然后调整核酸的浓度或核酸的量至指定值，从而标准化。对于许多标准化的工艺，特别是自动化工艺，为获得可重现的结果，如此标准化常常是必要的。因为该原因，有大量的方法用于定量纯化样本中的核酸。一个常见的定量方法的例子是分光光度法测定样本中DNA的量。随后测定样本中核酸的浓度，然后浓度可以被统一调整。另一已知的定量核酸的方法是基于添加染料，如溴化乙锭，SYBRGreen或Picogreen。通过将测量值与标准曲线进行比较可以测定浓度。除描述的光谱测定或基于荧光的定量技术外，各种不同的纯化技术在现有技术中也是已知的，据说允许从不同的原材料中制备的核酸的浓度相同。Promega的MagneSil试剂盒或Invitrogen的SequalPrep试剂盒就是例子。例如，Promega的MagneSil试剂盒被用于从全血中分离基因组DNA。该试剂盒是基于在离液序列高的盐的条件下，DNA结合到外覆氧化硅的顺磁性的颗粒。结果，在用低盐缓冲液或水洗脱后，通常得到1μg(±50％)纯化的基因组DNA。由于多达50％相对大的波动，该方法需要改进。Invitrogen的SequalPrep试剂盒是基于DNA结合到覆盖有离子交换剂的表面。DNA在酸性pH条件下结合，且采用强碱性的缓冲液进行洗脱，该缓冲液的pH高于离子交换剂的pKs值。该试剂盒是基于所谓的电荷-转换技术(见上)。该试剂盒发现在长片段PCRs(LRPCRs)的纯化和标准化中的应用，它也适用于用于测序的样本制备。厂商阐明当使用至少250ng源DNA时，产量约25ng，具有2-3倍的波动。这意味着这里的波动也是相对大的，以致需要再一次优化。因此事实上已知的纯化技术在产量方面仍具有宽的变动。难题产生了，特别是当使用不同量的原材料或不同的原材料时。因此对于样本材料，期望在分离过程中，除了获得纯化的核酸，还纯化定量的核酸，从而已经获得洗脱液，该洗脱液在不同的样本之间具有几乎相同浓度的核酸，在浓度上具有最小可能的波动。此外，对于纯化的核酸，期望能够立即准备好，在进一步应用中使用，即，如，不需要进一步再用缓冲液处理或类似步骤。基于现有技术已知的纯化技术，这不总是可能的，因为这些常常需要高pH值和/或高盐浓度用于纯化核酸的洗脱。因此，经常需要预先使纯化的核酸沉淀或其他，如为随后的应用(下游应用)调节pH，但是其结果是，洗脱液中的浓度可能再次改变。尽管已知的技术适用于核酸的纯化，对于定量的核酸的纯化有所保留，目前的方法需要改进，特别是允许源自不同的样本的定量的核酸的纯化，在纯化核酸的浓度上仅具有小的波动。因此，本专利技术待解决的问题是对现有的各种纯化核酸的方法进行改进。本专利技术采用用于从包含核酸的样本分离和/或纯化定量的核酸的方法来解决该问题，该方法至少具有以下步骤：a.将包含核酸的样本与定量的核酸结合相接触，该核酸结合相具有以下特征：(i)核酸结合相具有核酸结合配体，该配体具有至少一个可质子化的基团；(ii)核酸结合配体结合于载体，(iii)核酸结合相具有低电荷密度的表面，其中，样本中核酸的量超过使用的核酸结合相的结合能力；b.在低于至少一个可质子化的基团的pKs值的pH(结合pH)条件下，核酸结合到核酸结合相；c.在高于结合pH的pH条件下，洗脱核酸，从而得到定量的核酸。本专利技术涉及核酸的分离和/或纯化，借助于特别的核酸结合相，允许从样本中纯化/分离定量的核酸，具有小的浓度波动。对于此，核酸结合相的设计是关键性的。为从样本中结合核酸，后者具有核酸结合配体，配体具有至少一个可质子化的基团。合适的可质子化的基团，特别是氨基，在下文详细描述。核酸的结合在低于至少一个这些可质子化的基团的pKs值的pH条件下发生。可质子化的基团获得一个或多个质子，从而带有正电，这意味着核酸结合相能够与带有负电荷的核酸结合。洗脱发生在较高的pH条件下，以致可质子化的基团的正电荷变得更少，且结合到核酸结合相上的核酸被释放。根据一些实施方式，可质子化的基团在洗脱过程中甚至可以是中性的，或选择性地也能是带负电的。该方法能被用于从生物学样本中分离和/或纯化核酸。此外，例如，为了使已经纯化的核酸标准化，从而得到定量的核酸，该方法可以在经典的核酸纯化技术后实施。本专利技术必要的特征在于核酸结合相的表面。根据本专利技术，该表面具有低电荷密度。该特殊的表面，与以下特征组合，所述特征是指样本中核酸的量超过使用数量的核酸结合相的结合能力，出人意料地具有以下效果：定量的核酸可以从样本中分离，其中，与现有技术相比，产生非常小的核酸浓度波动。与现有技术相反，根据本专利技术，没有试图获得允许特别大量核酸结合的表面。相反，表面上的电荷密度以及因此的核酸结合相的核酸结合能力被有意地降低。因此，仅有有限量的核酸，但总是相同的，即为特别的样本限定的，能够被结合，且相应地被洗脱。因此，对于特殊的生物学样本材料来说，有利地，核酸结合相的结合能力必须仅一次测定。进一步的纯化步骤可以被省略，因为特定量的核酸结合相仅可以结合定量的、且因此总是相同量的核酸。结果，有利地，处理步骤如纯化样本的浓缩或稀释可以被省略，这在其他方面、为将所有样本调节到纯化核酸的浓度相同，是必需的。术语“定量”特别是指在限定的，即窄的变化范围内核酸的浓度。当后者对于特殊的样本或样本材料来说是未知的，变化的范围可以被测定(实验式地)。优选地，根据本专利技术的方法获得的核酸的量或浓度是在窄的范围内，以致于，取决于样本材料，变化小于±30％，优选小于±20％，特别是在±15％的范围内，且特别优选±10％。与样本中核酸的量/浓度相关的核酸结合相的量应该更好地被选择，以致它总处于稳定区域，且因此处于核酸结合相的核酸结合能力的饱和区域。因此，选择核酸结合相的量(例如颗粒的量或表面包覆核酸结合配体的载体的大小)，从而使样本中的核酸是超过使用的核酸结合相的量的核酸结合能力。由于本专利技术的核酸结合相的弱的核酸结合能力，本专利技术的方法与使用具有强的核酸结合能力的核酸结合相/颗粒(例如氧化硅颗粒或传统聚胺包覆的颗粒)相比具有明显的优势。在现有技术中，或者必须接受核酸产量上高的波动，或者必须使用如此本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2009.05.12 EP 09160078.3;2009.06.03 EP 09007338.81.一种从包含核酸的样本分离和/或纯化定量的核酸的方法，该方法具有至少以下步骤：a.将所述包含核酸的样本与定量的核酸结合相接触，该核酸结合相具有以下特征：(i)所述核酸结合相具有核酸结合配体，该配体具有至少一个可质子化的基团；(ii)所述核酸结合配体结合于载体；(iii)所述核酸结合相具有低电荷密度的表面，其中，通过以下特征获得低电荷密度：结合于载体的所述核酸结合配体，都具有不多于一个或两个用于结合核酸的可质子化的基团，且所述样本中核酸的量超过所使用数量的所述核酸结合相的结合能力；b.在低于至少一个可质子化的基团的pKs值的pH条件下，使所述核酸结合于所述核酸结合相；c.在高于结合pH的pH条件下，洗脱核酸，从而得到定量的核酸。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述核酸结合配体选自一元胺和二元胺构成的组。3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，可质子化的基团具有一个或多个以下特征：a.pKs值为9到12；b.pKs值为10到12；c.所述可质子化的基团是氨基，且不与降低电子密度的基团结合。4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述核酸结合相具有至少一个或多个以下特征：a.所述载体和/或核酸结合配体具有在洗脱pH值条件下促进核酸释放的官能团，即阳离子交换剂作为官能团；b.所述核酸结合配体选自包含下式的伯、仲和叔胺的组：R3N，R2NH，RNH2和/或X-(CH2)n-Y其中X为R2N，RNH或NH2，Y为R2N或RNH或NH2，R是彼此独立的，为直链、支链或环状的烷基、烯基、炔基或芳香取代基，其中，所述取代基也可以包含一个或多个杂原子；n为0到20；c.所述载体除了所述核酸结合配体之外，本身不具有核酸结合特性；d.所述载体选自下组：有机聚合物；多糖和水凝胶；无机载体，金属氧化物和非金属氧化物，具有金属表面的载体和磁性颗粒及其混合物，管、膜、羊毛织物、纸、多孔板、芯片和微阵列；和/或e.结合能力在每mg核酸结合相0.1至500μg核酸的范围内。5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述载体包覆着核酸结合配体和稀释配体的混合物，和/或所述结合到载体的核酸结合配体是不足量的。6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在具有至少一个以下特征的条件下进行结合：a.在pH3～8进行结合；和/或b.在pH4～7.5进行结合；和/或c.在pH4.5～7进行结合；和/或d.在pH5.5～7进行结合；和/或e.在pH6.5～7进行结合；和/或f.在盐浓度≤1M，≤0.5M，≤0.25M或≤0.1M条件下进行结合。7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，在具有至少一个以下特征的条件下进行洗脱：a.洗脱在以下pH条件下进行，该pH高于所述结合pH，但比至少一个可质子化的基团的pKs值低至少一个pH单位；和/或b.在pH7.5～10进行洗脱；和/或c.在pH8～9进行洗脱；和/或d.在pH8.2～8.8进行洗脱；和/或e.在盐浓度≤1M，≤0.5M，≤0.25M，≤0.1M，≤25mM，≤15mM，或≤10mM的条件下进行洗脱；和/或f.为了洗脱，使用的溶液选自下组：水、有机的缓冲液。8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，洗涤步骤在结合后且在洗脱前实施。9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，使用具有一个或多个以下特征的洗涤溶液：a.使用水或具有低盐浓度的水性溶液用于所述洗涤步骤；和/或b.使用具有低盐浓度的水性溶液，其中盐浓度≤400mM，≤200mM，≤100mM，≤50mM和/或≤25mM。10.如权利要求4所述的方法，其特征在于，所述有机聚合物选自下组：聚苯乙烯及其衍生物、聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯及其衍生物、聚氨酯、尼龙、聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯和这些材料的共聚物；所述多糖选自下组：琼脂糖、纤维素、葡聚糖、交联葡聚糖，聚丙烯酰胺葡聚糖，壳聚糖；所述无机载体为玻璃；和所述金属氧化物和非金属氧化物选自下组：Al2O3、TiO2、氧化硅、氧化硼。11.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述载体为反应容器。12.核酸结合相在从包含核酸的样本分离和/或纯化定量的核酸中的应用，其特征在于，所述核酸结合相具有核酸结合配体，该核酸结合配体具有至少一个可质子化的基团，其中所述核酸结合配体结合于载体，且所述核酸结合相具有低电荷密度的表面，其中通过一个或多个以下特征，获得低电荷密度：a.结合于载体的所述核酸结合配体，都具有不多于一个或两个用于结合核酸的可质子化的基团；和/或b.所述核酸结合配体选自一元-和二元胺构成的组；其中，高于所述结合pH的洗脱pH被确定，且其中选择核酸结合相的量，从而使样本中所述核酸超过使用的所述核酸结合相的结合能力。13.如权利要求12所述的应用，其特征在于，所述核酸结合相具...

【专利技术属性】
技术研发人员：J·佩策尔，H·韦德勒，R·法比斯，
申请(专利权)人：凯杰有限公司，
类型：发明
国别省市：