一种高山离子芥悬浮胚性愈伤转化的方法技术

本发明专利技术涉及一种高山离子芥悬浮胚性愈伤转化的方法。本方法通过(1)悬浮胚性愈伤的培养；(2)菌株的活化及菌种的准备；(3)根癌农杆菌侵染；(4)悬浮胚性愈伤与根癌农杆菌共培养，并采用GUS染色技术来鉴别转基因愈伤组织对外源基因的表达，在含有50μmol/L乙酰丁香酮的培养基上共培养的悬浮胚性愈伤组织经染色及脱色后在解剖镜下观察有大面积的细胞，呈蓝色，转化效率为80％左右。本发明专利技术操作比较简便，易于掌握，实施条件宽松，重复性高。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种冰缘植物转化的方法，特别是涉及根癌农杆菌介导的高山离子芥悬浮胚性愈伤转化的方法。
技术介绍
高山离子芥是十字花科离子芥属多年生植物，分布在高海拔亚高山草甸和砾石质山坡上。其环境条件的特点是气候寒冷、空气稀薄、辐射强、劲风。本实验采样地处于43.05N，86.49E的乌鲁木齐河源区流石碓，海拔3600～3900m。该地区年平均气温在-5～-7℃之间，6～8月平均气温为3.6℃，气温日差较大，是一种伴随反复冻融环境的高寒植物。利用生物技术手段，将外源基因导入高山离子芥悬浮胚性愈伤中，有利于研究冰缘植物的的各种生理生化过程。目前，在高山离子芥一些抗冻、抗寒、耐盐等基因及其功能的研究中，都是将外源基因介入烟草、拟南芥中研究其功能。但是，并没有任何报道有将高山离子芥的抗性基因导入其自身中研究其基因功能，其主要的技术问题在于，尚未建立高山离子芥的转化体系。高山离子芥转化方法的建立，有助于研究高山离子芥自身特有的差异表达的基因、蛋白相互作用等，为研究高山冰缘植物提供了新方法，新思路，具有很好的应用前景。近几年来，胚性愈伤作为转化的受体系统倍受关注，先后在柑橘、茶树、棉花、可可、苜蓿等作物上取得成功，但在高山离子芥中未见报到。1988年发现，该受体系统由于胚性细胞团中可增殖的胚性细胞处于表面及近表面，且能在众多的位点上形成体细胞胚，使转化方便而高效。另外，1993年Sato等人和1997年Trick等人(Sato S et al，Plant Cell Pep.，1993；Tricket al，Plant Tissue Cult Biotech，1997)分别发现在胚性细胞团增殖培养过程中，由于培养液与胚性细胞团充分接触，可进行高效筛选获得均一的转化胚性细胞团，进而获得大量转化的非嵌合的体细胞胚以再生转化植株。由于培养液与胚性细胞团充分接触，相对于在固体培养基上培养的愈伤组织，悬浮胚性愈伤大部分是游离的单细胞状态，更有利于高效的转入外源基因。我们借鉴胚性愈伤转化在其他作物上取得的成功经验，探索了一条利用高山离子芥悬浮胚性愈伤作为转化受体的转化途径。高山离子芥是一种野生的药用高寒植物，具有极高的营养价值。悬浮胚性愈伤可以作为植物生物反应器，安全快捷地高效表达外源基因。利用生物技术手段，向高山离子芥基因组中导入外源基因，培育抗病，抗虫，抗干旱，抗冻等高品质的转基因高山离子芥新品种，有利于研究冰缘植物的各种生理生化过程，为冰缘植物的遗传改良工作提供了一条有效的途径。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种高山离子芥悬浮胚性愈伤转化的方法，通过建立一个适合多种外源基因转入高山离子芥基因组中悬浮胚性愈伤的转基因体系，该体系经GUS染色鉴定后，发现转化率高达80％左右，并利用高山离子芥悬浮胚性愈伤为转化受体，培育抗病，抗虫，抗干旱，抗冻等高品质的转基因高山离子芥新品种。为实现上述目的本专利技术所采用的技术方案是：一种高山离子芥悬浮胚性愈伤转化的方法，其步骤是：(1)悬浮胚性愈伤的培养选取颜色嫩黄活力旺盛的高山离子芥的愈伤组织块，置于三角瓶中的液体培养基中于摇床上，以120-130rpm的转速下悬浮培养，悬浮胚性愈伤液体基本培养基为MS，添加外源激素为6-BA、NAA和KT；6-BA的浓度为0.1-0.3mg/L，NAA的浓度为0.1-0.2mg/L，KT的浓度为0.2-0.3mg/L；液体培养基的PH为5.8-6.0；对三角瓶装有的悬浮胚性愈伤连续光照8-12小时，再连续黑暗12-16小时，温度为18-20℃。每隔6到9天继代一次；继代时悬浮胚性愈伤与新鲜培养基的体积比为1∶4，继代两次到三次以后，悬浮液中布满了大量体积均一的米黄色小胚，呈游离态的单细胞；(2)菌株的活化及菌种的准备取低温甘油保存的根癌农杆菌，根癌农杆菌涂布于含50mg/L卡那霉素(Kan)、50mg/L利福平(Rifampicin，RFP)的Yeast Extract Peptone(YEP)固体培养基上，28℃下培养箱中避光倒置培养，使其活化；3d后，挑取含重组质粒的根癌农杆菌单菌落，接种于含Kan，利福平(Rifampicin，RFP)的YEP液体培养基中，28℃，避光，200rpm振荡培养过夜；取培养过夜的根癌农杆菌菌液转接到含相同抗生素的液体YEP培养基中，继续避光培养3-5小时，然后，以转速6000rpm离心8min，收集菌液于离心管中，用分子枪吸液体基本培养基MS吹悬根癌农杆菌菌体，加入乙酰丁香酮，调整OD600值为0.5-0.7备用；(3)根癌农杆菌侵染从摇床上取下步骤(1)中装有培养悬浮胚性愈伤的三角瓶，静置，待悬浮胚性愈伤沉于三角瓶底部后，将上层的液体培养基倒出，再用上述备用的菌液重悬三角瓶底部的悬浮胚性愈伤，然后将三角瓶放入转速为40-50rpm的摇床上摇动，使悬浮胚性愈伤能充分的和菌液接触，均匀分布，温度为20℃，时间为20-30min。(4)悬浮胚性愈伤与根癌农杆菌共培养从摇床上再取下装有被根癌农杆菌侵染后的悬浮胚性愈伤的三角瓶，静置，待悬浮胚性愈伤沉于三角瓶底部，将三角瓶中的菌液倒出，再将沉于三角瓶底悬浮胚性愈伤组织置于在无菌的滤纸上放干，保证菌液吸干，用无菌镊子接至含有乙酰丁香酮、PH为5.8～6.0的固体培养基MS上，20℃暗培养3天，得外源基因导入的悬浮胚性愈伤组织。本专利技术与现有的技术相比所具有的优点和产生的有益效果：1、转化效率高目前为止，本专利技术的转化率为80％左右，迄今为止尚未有高山子离子芥的转化体系的相关报道，此转化率已是较高的。而且，在提高转化效率方面使用了乙酰丁香酮，发现在乙酰丁香酮浓度为50umol/L时，转化效率能达到80％左右。2、适应范围广本专利技术的高山离子芥悬浮胚性愈伤转化体系应用于多种基因，如抗冻基因COR基因，FZF转录因子，海藻糖磷酸合成酶5基因(TPS5)基因等都可利用此方法导入高山离子芥悬浮胚性愈伤中进行蛋白质相互作用等进一步的功能研究。3、操作比较简便，实施条件宽松，效果非常明显。整个实验过程的周期短，可观察外源基因转入的瞬时表达情况，且实验中所使用的仪器都是实验室的常规仪器，操作起来十分便捷。4、本专利技术易于掌握，重复性高。在整个实验过程中，经过多个重复实验，均能稳定得到转化效率较高(80％左右)的实验结果，具有稳定性。5、本专利技术使用的高山离子芥的悬浮胚性本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种高山离子芥悬浮胚性愈伤转化的方法，其步骤是：（１）悬浮胚性愈伤的培养选取颜色嫩黄活力旺盛的高山离子芥的愈伤组织块，置于三角瓶中的液体培养基中于摇床上，以１２０－１３０ｒｐｍ的转速下悬浮培养，悬浮胚性愈伤液体基本培养基为ＭＳ，添加外源激素为６－ＢＡ、ＮＡＡ和ＫＴ；６－ＢＡ的浓度为０．１－０．３ｍｇ／Ｌ，ＮＡＡ的浓度为０．１－０．２ｍｇ／Ｌ，ＫＴ的浓度为０．２－０．３ｍｇ／Ｌ；液体培养基的ＰＨ为５．８－６．０；对三角瓶装有的悬浮胚性愈伤连续光照８－１２小时，再连续黑暗１２－１６小时，温度为１８－２０℃，每隔６到９天继代一次；继代时悬浮胚性愈伤与新鲜培养基的体积比为１∶４，继代两次到三次以后，悬浮液中布满了大量体积均一的米黄色小胚，呈游离态的单细胞；（２）菌株的活化及菌种的准备取低温甘油保存的根癌农杆菌，根癌农杆菌涂布于含５０ｍｇ／Ｌ卡那霉素（Ｋａｎ）、５０ｍｇ／Ｌ利福平（Ｒｉｆａｍｐｉｃｉｎ，ＲＦＰ）的Ｙｅａｓｔ　Ｅｘｔｒａｃｔ　Ｐｅｐｔｏｎｅ（ＹＥＰ）固体培养基上，２８℃下培养箱中避光倒置培养，使其活化；３ｄ后，挑取含重组质粒的根癌农杆菌单菌落，接种于含Ｋａｎ，利福平的ＹＥＰ液体培养基中，２８℃，避光，２００ｒｐｍ振荡培养过夜；取培养过夜的根癌农杆菌菌液转接到含相同抗生素的液体ＹＥＰ培养基中，继续避光培养３－５小时，然后，以转速６０００ｒｐｍ离心８ｍｉｎ，收集菌液于离心管中，用分子枪吸液体基本培养基ＭＳ吹悬根癌农杆菌菌体，加入乙酰丁香酮，调整ＯＤ６００值为０．５－０．７备用；（３）根癌农杆菌侵染从摇床上取下步骤（１）中装有培养悬浮胚性愈伤的三角瓶，静置，待悬浮胚性愈伤沉于三角瓶底部后，将上层的液体培养基倒出，再用上述备用的菌液重悬三角瓶底部的悬浮胚性愈伤，然后将三角瓶放入转速为４０－５０ｒｐｍ的摇床上摇动，使悬浮胚性愈伤能充分的和菌液接触，均匀分布，温度为２０℃，时间为２０－３０ｍｉｎ；（４）悬浮胚性愈伤与根癌农杆菌共培养从摇床上再取下装有被根癌农杆菌侵染后的悬浮胚性愈伤的三角瓶，静置，待悬浮胚性愈伤沉于三角瓶底部，将三角瓶中的菌液倒出，再将沉于三角瓶底悬浮胚性愈伤组织置于在无菌的滤纸上放干，保证菌液吸干，用无菌镊子接至含有乙酰丁香酮、ＰＨ为５．８～６．０的固体培养基ＭＳ上，２０℃暗培养３天，得外源基因导入的悬浮胚性愈伤组织。...

【技术特征摘要】
1.一种高山离子芥悬浮胚性愈伤转化的方法，其步骤是：
(1)悬浮胚性愈伤的培养
选取颜色嫩黄活力旺盛的高山离子芥的愈伤组织块，置于三角瓶中的液
体培养基中于摇床上，以120-130rpm的转速下悬浮培养，悬浮胚性愈伤液体
基本培养基为MS，添加外源激素为6-BA、NAA和KT；6-BA的浓度为
0.1-0.3mg/L，NAA的浓度为0.1-0.2mg/L，KT的浓度为0.2-0.3mg/L；液体培
养基的PH为5.8-6.0；对三角瓶装有的悬浮胚性愈伤连续光照8-12小时，
再连续黑暗12-16小时，温度为18-20℃，每隔6到9天继代一次；继代时
悬浮胚性愈伤与新鲜培养基的体积比为1∶4，继代两次到三次以后，悬浮液
中布满了大量体积均一的米黄色小胚，呈游离态的单细胞；
(2)菌株的活化及菌种的准备
取低温甘油保存的根癌农杆菌，根癌农杆菌涂布于含50mg/L卡那霉素
(Kan)、50mg/L利福平(Rifampicin，RFP)的Yeast Extract Peptone(YEP)
固体培养基上，28℃下培养箱中避光倒置培养，使其活化；3d后，挑取含
重组质粒的根癌农杆菌单菌落，接种于含Kan，利福平的...

【专利技术属性】
技术研发人员：安黎哲，尚琛晶，张华，樊小川，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：62