本发明专利技术提供一种醉马草成熟胚愈伤组织诱导及再生体系建立方法，步骤如下：1）选择醉马草种子并消毒；2）诱导培养基、分化增殖培养基和生根培养基的筛选；3）成熟胚的处理和诱导分化：取步骤1）中消毒的醉马草种子，依次在诱导培养基、分化和增殖培养基和生根培养基中进行培养，待分化苗的根长4‑6cm时，将瓶苗移出，闭瓶炼苗，2d后注入自来水，开瓶炼苗3d，然后洗净根部，灭菌，用基质培养，获得完整的再生植株。本发明专利技术选用醉马草成熟胚为外植体进行组织再生培养，不受取材材料时空限制。本发明专利技术的方法操作简单，成本廉价；建立的醉马草成熟胚培养植株再生方法体系，为进行遗传转化和性状改良提供重要的基础性资料。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于农业栽培中通过组织培养技术的植物再生领域，具体涉及一种醉马草成熟胚愈伤组织诱导及再生体系建立方法。
技术介绍
醉马草为禾本科、芨芨草属的多年生植物，是我国北方草原主要的烈性毒草之一， 广泛分布在我国甘肃、新疆、内蒙古、青海等省区（史志诚，1997）。醉马草具有抗高寒、耐干旱等优势，加之家畜对其多不食，因此其在退化草地群落种间竞争中具有较大的优势，面积不断扩大，特别是在干旱、退化的草地中蔓延日益严重，某些省（区）醉马草已成为优势种群（李学森，1996）。组织培养是指在无菌条件下利用人工培养基对植物组织进行培养，是生物工程研究的基础，也是进行遗传转化和植物改良研究的基本环节。组织培养技术既不受季节限制、也不受地理位置限制，且遗传背景一致、生长周期短、成本低。醉马草作为一种颇具开发价值的禾草，有较强的抗逆性，自生繁衍能力强，适应性广等特点，由于醉马草根系发达、枝叶茂盛、具有极强的生命力、繁殖力、耐旱耐寒力，可以用作荒漠沙化土地等非放牧地区的防风固沙和水土保持植物，在干旱半干旱的恶劣环境条件下，醉马草在草地群落中具有明显的生长优势。目前，以醉马草成熟胚为外植体进行组织培养的研究还鲜有报道，因此建立以醉马草成熟胚为外植体的组织培养再生体系很有必要，同时也为今后的转基因研究奠定了基础。
技术实现思路
为了解决现有技术中存在的问题，本专利技术提供了一种醉马草成熟胚愈伤组织诱导及再生体系建立方法；通过醉马草成熟胚为外植体，构建愈伤组织诱导、植株再生获得再生体系，为进行遗传转化和性状改良提供重要的基础性材料。本专利技术提供一种醉马草成熟胚愈伤组织诱导及再生体系建立方法，步骤如下：（1）选择醉马草种子并消毒；（2）诱导培养基、分化增殖培养基和生根培养基的筛选：诱导培养基：基础培养基+0.1-0.5 mg·L-1 6-BA +1.0-3.0 mg·L-1 2,4-D；分化增殖培养基：基础培养基+0.5-3.0mg/L 6-BA + 0.1-0.3mg/L NAA，生根培养基：1/2基础培养基+0.1-0.4 mg/L NAA；所述基础培养基为：MS培养基+蔗糖30g·L-1+琼脂10g·L-1；（3）成熟胚的处理和诱导分化：取步骤（1）中消毒的醉马草种子，置于诱导培养基中培养，继代几次后转入分化和增殖培养基中继续培养，继代几次后转入生根培养基中进行培养，待分化苗的根长4-6cm时，将瓶苗移出，闭瓶炼苗，2d后注入自来水，开瓶炼苗3d，然后洗净根部，灭菌，用基质培养，获得完整的再生植株。作为优选，所述醉马草为夏河醉马草、天祝醉马草或新疆醉马草。作为优选，当醉马草为夏河醉马草时，愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+0.3 mg·L-1 6-BA +3.0 mg·L-1 2,4-D；分化增殖培养基为：基础培养基+0.5mg/L6-BA + 0.2mg/L NAA；生根培养基为：1/2基础培养基+0.1 mg/L NAA。作为优选，当醉马草为天祝醉马草时，愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+0.5 mg·L-1 6-BA+3.0 mg·L-1 2,4-D；增殖培养基为：基础培养基+3.0mg/L6-BA + 0.1mg/L NAA；生根培养基为：1/2基础培养基+0.2 mg/L NAA。作为优选，当醉马草为新疆醉马草时，愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+ 0.5 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 2,4-D；增殖培养基为：基础培养基+1.5mg/L6-BA + 0.2mg/L NAA；生根培养基为：1/2基础培养基+0.4 mg/L NAA。作为优选，步骤（3）中所述诱导培养的培养条件为：于恒温25±2℃条件下黑暗培养30d。作为优选，步骤（3）中所述分化增殖培养的培养条件为：光照培养，光照强度1500-2000Lux，每天光照16 h·d-1，培养温度为25℃。作为优选，步骤（3）中所述生根培养的培养条件为：在 25±2℃、光照强度为2000-3000lx、光照时间16h·d-1条件下培养。本专利技术的有益效果如下：（1）本专利技术公开了一种醉马草成熟胚愈伤组织诱导培养及再生体系的构建方法，以采集夏河、新疆和天祝的醉马草成熟胚为外植体，通过不同生长调节物质对愈伤组织的诱导、分化、生根等步骤的影响，进行各种培养基的筛选，获得以下最佳培养基以及最佳培养条件，提供了一种有效的适宜于不同生态型的醉马草组织培养方法。最佳培养基如下：基础培养基为MS培养基加蔗糖30g·L-1和琼脂10g·L-1；A、出愈率较高的诱导培养基分别为：1）夏河醉马草：基础培养基+0.3 mg·L-1 6-BA +3.0 mg·L-1 2,4-D，诱导率为93%；（2）天祝醉马草：基础培养基+0.5 mg·L-1 6-BA+3.0 mg·L-1 2,4-D，诱导率为96%；(3)新疆醉马草：基础培养基+ 0.5 mg·L-1 6-BA+1.0 mg·L-1 2,4-D诱导率为95%。B、最佳分化和不定芽增殖培养基为 ：（1）夏河醉马草：基础培养基+0.5mg/L 6-BA + 0.2mg/L NAA，增殖率90%；（2）天祝醉马草：基础培养基+3.0mg/L 6-BA + 0.1mg/L NAA，增殖率83%； (3)新疆醉马草 基础培养基+1.5mg/L 6-BA + 0.2mg/L NAA，增殖率88%。C、最佳生根成苗培养基为：（1）夏河醉马草：1/2基础培养基+0.1 mg/L NAA；（2）天祝醉马草：1/2基础培养基+0.2 mg/L NAA；(3)新疆醉马草：1/2基础培养基+0.4 mg/L NAA，生根率均达100%。（2）本专利技术选用醉马草成熟胚为外植体，进行组织再生培养，不受取材材料时空限制。本专利技术为醉马草愈伤组织诱导的组培方法，操作简单，成本廉价；建立的醉马草成熟胚培养植株再生方法体系，为进行遗传转化和性状改良提供重要的基础性资料。附图说明附图用来提供对本专利技术的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与本专利技术的实施例一起用于解释本专利技术，并不构成对本专利技术的限制。在附图中：图1为夏河醉马草成熟胚诱导愈伤组织；图2为夏河醉马草愈伤组织分化绿苗；图3为夏河醉马草生根的幼苗；图4为夏河醉马草移栽后的再生植株。具体实施方式以下的实施例便于更好地理解本专利技术，但并不限定本专利技术。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为市售。本专利技术的方法具体步骤如下：（1）植物材料选取及处理：选择色泽、大小均匀的醉马草成熟种子，去除外稃后在流水下冲洗30分钟，然后用75%酒精处理5min，无菌水冲洗2-3次，用10%次氯酸钠消毒10min，无菌水冲洗3-5次，将种子置于无菌滤纸，直至种子水分吸干后待用；所述的醉马草种子指的是：采集于夏河、新疆和天祝的醉马草种子。（2）诱导和分化增殖培养基筛选：基础培养基为MS培养基加蔗糖30g·L-1和琼脂10g·L-1；诱导培养基、分化增殖培养基为基础培养基附加不同处理激素。诱导培养基是在基础培养基的基础上添加6-BA和2,4-D。设置6-BA浓度为0.1mg·L-1、0.3mg·L-1、0.5mg·L-1；2,4-D本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种醉马草成熟胚愈伤组织诱导及再生体系建立方法，其特征在于：步骤如下：（1）选择醉马草种子并消毒；（2）诱导培养基、分化增殖培养基和生根培养基的筛选：诱导培养基：基础培养基+0.1‑0.5 mg·L‑1 6‑BA +1.0‑3.0 mg·L‑1 2,4‑D；分化增殖培养基：基础培养基+0.5‑3.0mg/L 6‑BA + 0.1‑0.3mg/L NAA，生根培养基：1/2基础培养基+0.1‑0.4 mg/L NAA；所述基础培养基为：MS培养基+蔗糖30g·L‑1+琼脂10g·L‑1；（3）成熟胚的处理和诱导分化：取步骤（1）中消毒的醉马草种子，置于诱导培养基中培养，继代几次后转入分化和增殖培养基中继续培养，继代几次后转入生根培养基中进行培养，待分化苗的根长4‑6cm时，将瓶苗移出，闭瓶炼苗，2d后注入自来水，开瓶炼苗3d，然后洗净根部，灭菌，用基质培养，获得完整的再生植株。
【技术特征摘要】
1.一种醉马草成熟胚愈伤组织诱导及再生体系建立方法，其特征在于：步骤如下：（1）选择醉马草种子并消毒；（2）诱导培养基、分化增殖培养基和生根培养基的筛选：诱导培养基：基础培养基+0.1-0.5 mg·L-1 6-BA +1.0-3.0 mg·L-1 2,4-D；分化增殖培养基：基础培养基+0.5-3.0mg/L 6-BA + 0.1-0.3mg/L NAA，生根培养基：1/2基础培养基+0.1-0.4 mg/L NAA；所述基础培养基为：MS培养基+蔗糖30g·L-1+琼脂10g·L-1；（3）成熟胚的处理和诱导分化：取步骤（1）中消毒的醉马草种子，置于诱导培养基中培养，继代几次后转入分化和增殖培养基中继续培养，继代几次后转入生根培养基中进行培养，待分化苗的根长4-6cm时，将瓶苗移出，闭瓶炼苗，2d后注入自来水，开瓶炼苗3d，然后洗净根部，灭菌，用基质培养，获得完整的再生植株。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述醉马草为夏河醉马草、天祝醉马草或新疆醉马草。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：当醉马草为夏河醉马草时，愈伤组织诱导培养基为：基础培养基+0.3 mg·L-1 6-BA +3.0 mg·L-1 2,4-D；分化增殖培养基为：基础培养基+0.5mg/L6-BA + 0.2mg/L NAA；生根培养基...
【专利技术属性】
技术研发人员：李春杰，王正凤，李秀璋，古丽君，
申请(专利权)人：兰州大学，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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