一种诱导棉花愈伤快速生长的处理方法技术

本发明专利技术公开了一种诱导棉花愈伤快速生长的处理方法，包括如下步骤：利用双氧水消毒处理棉花种子半小时，在超净台用灭菌水洗净双氧水后，用灭菌水浸泡种子，露白后种入MS培养基中，常规培养生长7天，取所得无菌幼苗下胚轴，农杆菌侵染后，转移放入共培养基上进行培养，黑暗条件下共培养48小时；共培养结束后，将所得的棉花下胚轴放入含有抗性筛选的愈伤诱导培养基中，置于单色蓝光下，16小时蓝光光照，8小时黑暗，间隔进行愈伤诱导，愈伤诱导结束后，待愈伤生长至约黄豆颗粒大小时，将获得的愈伤取下转入新鲜诱导培养基，继续增殖，直至进入胚型愈伤诱导阶段。本发明专利技术可有效加快植物愈伤诱导阶段的愈伤增殖生长，减少愈伤诱导周期。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及棉花组织培养领域，具体涉及一种诱导棉花愈伤快速生长的处理方法.
技术介绍
在棉花组织培育技术中，棉花愈伤培育是实现农杆菌侵染或基因枪转基因后体细胞培育第一个关键步骤，该技术决定着棉花愈伤形成的效率的高低，直接影响后续幼苗诱导形成、植株发育等试验阶段.因此，在组织培育中，提高棉花愈伤诱导增殖有利于缩短棉花再生植株培育时间.在试验过程中，棉花通过组织培育技术多用于利用转基因棉花的植株再生，目的是将外源目的基因转入常规棉花中，从而培育具有目的基因的棉花新种质资源，其常规组织培养方法为：培育棉花无菌苗，下胚轴切成1厘米的小段，利用携带外源目的基因的农杆菌侵染受体棉花下胚轴，或者非侵染的下胚轴.共培养后放入愈伤诱导培养基，愈伤分化成胚状体即胚型愈伤，胚型愈伤分化生成再生株，再生株移植等环节.其中，在整个愈伤培养过程中，愈伤生长增殖是组织培养的重要环节，该环节直接决定试验过程中愈伤继代时间和次数，以及后续分化诱导等试验进程。其常规愈伤继代方法为：下胚轴放入愈伤诱导培养基后，在16小时白光光照，8小时黑暗条件下，恒温28度，诱导下胚轴愈伤生长，期间根据培养基中养分的消耗，约每2-3月换一次愈伤诱导培养基，遇上增殖期间培养基换3-4次，直至愈伤生长到一定大小后，取下愈伤继续培养直至有胚性愈伤出现后诱导分化，该时间一般为8个月以上，甚至1年以上，因此愈伤诱导在棉花组织培养中是时间花费最长的一个阶段.期间愈伤由于长时间光照容易变绿色，并造成愈伤硬化和生长较慢.
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种诱导棉花愈伤快速生长的处理方法，其可有效加快棉花愈伤生长.为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案为：一种诱导棉花愈伤快速生长的处理方法，在单色蓝光下处理诱导棉花愈伤生长，如玉米、大豆、棉花等植物做为受体，以棉花为例，包括如下步骤：S1、利用15％双氧水过氧化氢消毒处理棉花种子半小时，倒去双氧水，在超净台用灭菌水清洗2-3次洗净双氧水后，用灭菌水浸泡种子24小时，露白后种入MS培养基中，常规培养生长7天，得无菌幼苗；S2、取所得无菌幼苗下胚轴，切段约1厘米，农杆菌侵染5-10分钟后，倒掉农杆菌菌液，用无菌滤纸吸干残留菌液，转移放入共培养基上进行培养，具体配方为MS4g/L、KNO31g/L、葡萄糖25g/L、琼脂6g/L、2，4-D100ul/L、KT100ul/L、固化剂3.5g/L。黑暗条件下共培养48小时.S3、共培养结束后，将所得的棉花下胚轴放入含有抗性筛选的愈伤诱导培养基中，具体配方为MS4g/L、KNO31g/L、葡萄糖25g/L、琼脂6g/L、2，4-D100ul/L、KT100ul/L、头孢0.5g/L.置于波长为450nm，光照强度为50-140勒克斯的单色蓝光下，16小时蓝光光照，8小时黑暗，间隔进行愈伤诱导1-2个月，期间根据需要换新鲜诱导培养基；具体配方为MS4g/L、KNO31g/L、葡萄糖25g/L、琼脂6g/L、2，4-D100ul/L、KT100ul/L、头孢0.5g/L，，S4、愈伤诱导约3-4个月，愈伤生长至约黄豆颗粒大小时，将获得的愈伤取下转入新鲜诱导培养基，具体配方为MS4g/L、KNO31g/L、葡萄糖25g/L、琼脂6g/L、2，4-D100ul/L、KT100ul/L、头孢0.5g/L，培养7个月后，形成胚型愈伤.比单独白光光照可提前1个月获得胚型愈伤，可明显加快后续试验进展.本专利技术具有以下有益效果：可有效加快棉花愈伤生长，同时降低了愈伤变绿.具体实施方式为了使本专利技术的目的及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本专利技术进行进一步详细说明.应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术.本专利技术实施例提供了一种诱导棉花愈伤快速生长的处理方法，包括如下步骤：实施例1：本实施例以蓝光条件下处理棉花愈伤诱导为例，以棉花为受体，转外源Cry1-RNAi基因，包括如下步骤：S1、利用15％双氧水过氧化氢消毒处理棉花种子半小时，倒去双氧水，在超净台用灭菌水清洗2-3次洗净双氧水后，用灭菌水浸泡种子24小时，露白后种入MS培养基中，常规培养生长7天，得无菌幼苗；S2、取所得无菌幼苗下胚轴，切段约1厘米，农杆菌侵染5-10分钟后，倒掉农杆菌菌液，用无菌滤纸吸干残留菌液，转移放入共培养基上进行培养，具体配方为MS4g/L、KNO31g/L、葡萄糖25g/L、琼脂6g/L、2，4-D100ul/L、KT100ul/L，黑暗条件下共培养48小时.S3、共培养结束后，将所得的棉花下胚轴放入含有抗性筛选的愈伤诱导培养基中，具体配方为MS4g/L、KNO31g/L、葡萄糖25g/L、琼脂6g/L、2，4-D100ul/L、KT100ul/L。置于波长为450nm，光照强度为50-140勒克斯的单色蓝光下，16小时蓝光光照，8小时黑暗，间隔进行愈伤诱导1-2个月，期间根据需要换新鲜诱导培养基；具体配方为MS4g/L、KNO31g/L、葡萄糖25g/L、琼脂6g/L、2，4-D100ul/L、KT100ul/L、头孢0.5g/L.S4、1-2个月愈伤诱导约，愈伤生长至约黄豆颗粒大小时，将获得的愈伤取下转入新鲜诱导培养基，具体配方为MS4g/L、KNO31g/L、葡萄糖25g/L、琼脂6g/L、2，4-D100ul/L、KT100ul/L、头孢0.5g/L，培养7个月后，形成胚型愈伤.实施例2：本实施例以蓝光条件下处理棉花愈伤诱导为例，以棉花为受体，转外源phyB-RNAi基因，包括如下步骤：S1、利用15％双氧水过氧化氢消毒处理棉花种子半小时，倒去双氧水，在超净台用灭菌水清洗2-3次洗净双氧水后，用灭菌水浸泡种子24小时，露白后种入MS培养基中，常规培养生长7天，得无菌幼苗；S2、取所得无菌幼苗下胚轴，切段约1厘米，农杆菌侵染5-10分钟后，倒掉农杆菌菌液，用无菌滤纸吸干残留菌液，转移放入共培养基上进行培养，具体配方为MS4g/L、KNO31g/L、葡萄糖25g/L、琼脂6g/L、2，4-D100ul/L、KT100ul/L，黑暗条件下共培养48小时.S3、共培养结束后，将所得的棉花下胚轴放入含有抗性筛选的愈伤诱导培养基中，具体配方为MS4g/L、KNO31g/L、葡萄糖25g/L、琼脂6g/L、2，4-D100ul/L、KT100ul/L.置于波长为450nm，光照强度为50-140勒克斯的单色蓝光下，16小时蓝光光照，8小时黑暗，间隔进行愈伤诱导1-2个月，期间根据需要换新鲜诱导培养基；具体配方为MS4g/L、KNO31g/L、葡萄糖25g/L、琼脂6g/L、2，4-D100ul/L、KT100ul/L、头孢0.5g/L.S4、1-2个月愈伤诱导约，愈伤生长至约黄豆颗粒大小时，将获得的愈伤取下转入新鲜诱导培养基，具体配方为MS4g/L、KNO31g/L、葡萄糖25g/L、琼脂6g/L、2，4-D100ul/L、KT100ul/L、头孢0.5g/L，培养7个月后，形成胚型愈伤.经检测不同时间内白光和蓝光条件下愈伤本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种诱导棉花愈伤快速生长的处理方法，其特征在于，在单色蓝光下处理诱导植物愈伤生长，包括如下步骤：S1、利用双氧水消毒处理棉花种子半小时，倒去双氧水，在超净台用灭菌水清洗2‑3次洗净双氧水后，用灭菌水浸泡种子24小时，露白后种入MS培养基中，常规培养生长7天，得无菌幼苗；S2、取所得无菌幼苗下胚轴，切段约1厘米，农杆菌侵染5‑10分钟后，倒掉农杆菌菌液，用无菌滤纸吸干残留菌液，转移放入共培养基上进行培养，该培养基为常规培养基，具体配方为MS 4g/L、KNO3 1g/L、葡萄糖25g/L、琼脂6g/L、2，4‑D、KT黑暗条件下共培养48小时；S3、共培养结束后，将所得的棉花下胚轴放入含有抗性筛选的愈伤诱导培养基中，具体配方为MS4g/L、KNO31g/L、葡萄糖25g/L、琼脂6g/L、2，4‑D、2，4‑D100ul/L、头孢0.5g/L，置于波长为450nm，光照强度为50‑140勒克斯的单色蓝光下，16小时蓝光光照，8小时黑暗，间隔进行愈伤诱导1‑2个月，期间根据需要换新鲜诱导培养基；具体配方为MS4g/L、KNO31g/L、葡萄糖25g/L、琼脂6g/L、2，4‑D、KT、筛选剂；S4、愈伤诱导约2‑3个月，待愈伤生长至约黄豆颗粒大小时，将获得的愈伤取下转入新诱导培养基中，具体配方为MS4g/L、KNO31g/L、葡萄糖25g/L、琼脂6g/L、2，4‑D100ul/L、KT100ul/L、头孢0.5g/L，培养7个月后，形成胚型愈伤。...

【技术特征摘要】
1.一种诱导棉花愈伤快速生长的处理方法，其特征在于，在单色蓝光下处理诱导植物愈伤生长，包括如下步骤：S1、利用双氧水消毒处理棉花种子半小时，倒去双氧水，在超净台用灭菌水清洗2-3次洗净双氧水后，用灭菌水浸泡种子24小时，露白后种入MS培养基中，常规培养生长7天，得无菌幼苗；S2、取所得无菌幼苗下胚轴，切段约1厘米，农杆菌侵染5-10分钟后，倒掉农杆菌菌液，用无菌滤纸吸干残留菌液，转移放入共培养基上进行培养，该培养基为常规培养基，具体配方为MS4g/L、KNO31g/L、葡萄糖25g/L、琼脂6g/L、2，4-D、KT黑暗条件下共培养48小时；S3、共培养结束后，将所得的棉花下胚轴放入含有抗性筛选的愈伤诱导培养基中，具体配方为MS4g/...

【专利技术属性】
技术研发人员：王霞，张元，陈磊，马燕斌，
申请(专利权)人：运城学院，
类型：发明
国别省市：山西;14