一种绿棉胚性愈伤组织的诱导和培养方法技术

本发明专利技术公开了一种绿棉胚性愈伤组织的诱导和培养方法，包括有以下步骤：绿棉种子消毒后剥去种皮进行培养，得到无菌苗下胚轴；无菌苗下胚轴置于绿棉愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养；转接至绿棉愈伤组织增殖培养基并继代培养；转入绿棉愈伤组织分化培养基，继代培养得到胚性愈伤组织；再进行扩繁培养。本发明专利技术的有益效果为：本发明专利技术提供的绿棉胚性愈伤组织的诱导和培养方法，耗时短，诱导率高，拓展了可再生棉花的基因型，适应于彩棉的绿棉品种，对彩棉转基因育种的发展壮大具有积极作用。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种植物领域组织培养的诱导和培养方法，具体涉及绿棉胚性愈伤组织的诱导和培养方法。
技术介绍
棉花是世界性重要经济作物，彩色棉作为棉花品种的一类，是重要的纯天然、无污染绿色纺织产品的重要原料之一，随着人们生活水平的日益提高和纺织工业的飞速发展倍受青睐。彩色棉的纤维具有天然的棕、绿、黄、红等多种颜色，用它进行纺织可以不使用对环境有害的油剂、浆料、染料和其它后处理剂，避免了化工染料对人体的毒害作用和对棉纤维自身优良品质的破坏。但彩棉一直都受到产量低、纤维品质差、遗传不稳定等因素的限制， 未能大面积示范推广。棉花转基因育种的突破极大地促进了世界棉花产业的发展，转基因育种作为传统育种的重要补充逐渐成为重要育种手段，拓展可再生彩棉品种基因型，尤其是具有重要推广价值的特色品种类型，胚性愈伤组织诱导是彩棉转基因研究的关键环节， 也是彩棉转基因育种，进行彩棉品种改良和品质改善的重要途径和方法，具有重要的研究价值和发展前景。在完成对棉花品质和抗性基因工程改造的同时，首先要建立一个高效的棉花再生体系。众所周知，棉花的再生工程受到基因型的限制很大，棉花的组织培养继代时间长，愈伤组织分化率低，重复性差。影响棉花体细胞再生的因素除外植体来源外，主要还有激素组合、培养基、氮源、碳源、无机盐、有机物等。目前仍旧没有任何一个体系可以完成对所有棉花品种的再生建立。目前所能做的就是扩展尽可能多得棉花品种来完成再生研究，在一定量的积累上实现质的突破。
技术实现思路
本专利技术的目的就是针对上述现有技术中的缺陷，克服了绿棉体细胞胚胎发生及植株再生的困难，提供了。为了实现上述目的，本专利技术提供的技术方案为，包括有以下步骤I)绿棉种子以硫酸脱绒后，再经过消毒洗涤，得到无菌绿棉种子，再将无菌绿棉种子在无菌环境下剥去种皮并接种于1/2MS固体培养基中，在光暗交替条件下进行培养，得到无菌苗下胚轴；2)将步骤I)得到的无菌苗下胚轴在无菌条件下切为5_8mm小段，并置于绿棉愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养30天，得到初级培养绿棉愈伤组织；3)将步骤2)得到的初级培养绿棉愈伤组织转接至绿棉愈伤组织增殖培养基并继代培养2次，得到增殖后绿棉愈伤组织；4)将步骤3)得到的增殖后绿棉愈伤组织转入绿棉愈伤组织分化培养基，继代培养2次，得到胚性愈伤组织；5)将步骤4)得到的胚性愈伤组织置于绿棉胚性愈伤组织增殖培养基上，进行扩繁培养。上述的诱导和培养方法，所述步骤I)中，硫酸脱绒所用的为95%的浓硫酸；消毒洗涤的过程为绿棉种子先以70%乙醇涮洗30s，再用30%过氧化氢浸泡3h， 无菌水冲洗5-8遍,最后用无菌水浸泡8-12h至种子露白；无菌绿棉种子的培养周期为4-8天，光暗交替过称为黑暗3-5天，关照1-3天。上述的诱导和培养方法，所述步骤2)中，绿棉愈伤组织诱导培养基为按照以下比例加入了 O. 05-0. 15mg/L的2，4- 二氯苯氧乙酸和O. 05-0. 3mg/L的N6-异戊烯腺嘌呤，或O. 05-0. 15mg/L 2，4_ 二氯苯氧乙酸、O. 05-0. 15mg/L N6-异戊烯腺嘌呤和 O. 1-0. 3mg/L吲哚乙酸的MSB培养基。上述的诱导和培养方法，所述步骤3)中，绿棉愈伤组织增殖培养基为按照以下比例加入了 O. 025-0. 075mg/L 2,4- 二氯苯氧乙酸和O. 05-0. 3mg/L N6-异戊烯腺嘌呤，或O. 05-0. 3mg/L N6-异戊烯腺嘌呤和O. 1-0. 3mg/L吲哚乙酸的MSB培养基。上述的诱导和培养方法，所述步骤4)中，绿棉愈伤组织分化培养基为按照以下比例加入了 I. 9-3. 8g/L KNO3 和 I. 8-2. 5g/L 凝固剂 gelrite 的 MSB 培养基。上述的诱导和培养方法，所述步骤5)中，绿棉胚性愈伤组织增殖培养基为按照以下比例加入了 1.9-3. 8g/L KN03、1. 8-2. Og/L 凝固剂 gelrite,O. 1-0. 5g/L 天冬酰胺和 O. I-ο. 5g/L谷氨酰胺并且原始配方中NH4NO3的加入量减半的MSB培养基。本专利技术的有益效果为本专利技术提供的绿棉胚性愈伤组织的诱导和培养方法，从外植体的培养到愈伤组织诱导，愈伤组织增殖分化，调节和筛选愈伤组织质地疏松无硬化、颜色浅绿、灰绿到黄绿的愈伤组织，对其增殖及分化过程的培养条件进行优化，最终研究得到胚性愈伤组织诱导时间可缩短至4-6个月，愈伤组织诱导率高达100 %，胚性愈伤组织分化率达10 %-20%,继代 15天后胚性愈伤组织的增殖倍数可达I. 5倍，可有效节省人力、物力的损耗。外植体培养是再生的第一步，无菌苗的生长情况直接关系愈伤组织的诱导。由于采用了暗光交替的培养， 为愈伤组织的诱导提供了分生能力最强时期的下胚轴。2，4-D在诱导愈伤组织中是必需的， 它启动细胞分裂速度快，诱导产生愈伤组织频率高、质量好，在棉花组织培养和遗传转化中被广泛应用。但2，4-D浓度过高会导致愈伤组织稀松褐化，且长期使用不利于后期胚性愈伤组织的产生。因此，在愈伤组织诱导期加入了合适浓度的KT和2，4-D，而在后期愈伤组织增殖继代中采取去除2，4-D或对其进行减半的方法，以避免对后期工作的阻碍。愈伤组织分化过程中则采用无激素的培养基更加有利于其分化。此时，因前期外源激素的累积，后期若再加入激素，可能会造成外源激素与愈伤组织体内激素的冲突，不利于后期培养。关于胚性愈伤组织的增殖，研究发现氮源减弱有利于胚性愈伤组织增殖，完全去除和使用全量的氮源都会影响其增殖。该方法耗时短，诱导率高，拓展了可再生棉花的基因型。适应于彩棉的绿棉品种，对彩棉转基因育种的发展壮大具有积极作用。具体实施例方式本专利技术技术方案材料中所提及的的MSB培养基，是一种常规培养基，其主要成分及用量如表I所示表I权利要求1.，其特征在于，包括有以下步骤1)绿棉种子以硫酸脱绒后，再经过消毒洗涤，得到无菌绿棉种子，再将无菌绿棉种子在无菌环境下剥去种皮并接种于1/2MS固体培养基中，在光暗交替条件下进行培养，得到无菌苗下胚轴；2)将步骤I)得到的无菌苗下胚轴在无菌条件下切为5-8_小段，并置于绿棉愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养30天，得到初级培养绿棉愈伤组织；3)将步骤2)得到的初级培养绿棉愈伤组织转接至绿棉愈伤组织增殖培养基并继代培养2次，得到增殖后绿棉愈伤组织；4)将步骤3)得到的增殖后绿棉愈伤组织转入绿棉愈伤组织分化培养基，继代培养2-3 次后，得到胚性愈伤组织；5)将步骤4)得到的胚性愈伤组织置于绿棉胚性愈伤组织增殖培养基上，进行扩繁培养。2.根据权利要求I所述的诱导和培养方法，其特征在于，所述步骤I)中，硫酸脱绒所用的为95%的浓硫酸；消毒洗涤的过程为绿棉种子先以70%乙醇涮洗30s，再用30%过氧化氢浸泡3h，无菌水冲洗5-8遍,最后用无菌水浸泡8-12h至种子露白；无菌绿棉种子的培养周期为4-8天，光暗交替过称为黑暗3-5天，关照1-3天。3.根据权利要求I或2所述的诱导和培养方法，其特征在于，所述步骤2)中，绿棉愈伤组织诱导培养基为按照以下比例加入了 O. 05-0. 15!^/1的2，4-二氯苯氧乙酸和O.05-0. 3mg/L的N6-异戊烯腺嘌呤，或O. 0本文档来自技高网...

【技术保护点】

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：罗俊杰，刘新星，陈玉梁，曲延英，陈子萱，李忠旺，
申请(专利权)人：甘肃省农业科学院生物技术研究所，
类型：发明
国别省市：