用于核酸等温扩增反应的微芯片、制造其的方法和核酸等温扩增反应方法技术

本发明专利技术涉及用于核酸等温扩增反应的微芯片、制造其的方法以及核酸等温扩增反应方法。更具体地，本发明专利技术提供一种用于核酸等温扩增反应的微芯片，其中对于核酸的等温扩增反应所需的物质中的至少一种存在于充当该反应的反应场所的反应区中，该物质中的至少一种利用在高于室温且低于该反应的反应温度的温度下发生熔化的薄膜覆盖。本发明专利技术提供了一种用于在等温扩增方法中准确控制反应时间的技术。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种用于核酸等温扩增反应(等温核酸扩增反应，isothermal nucleic-acid amplification reaction)的微芯片(microchip)、一禾中用于制造该微芯片的方法、以及一种核酸等温扩增方法。更具体地，本专利技术涉及一种用于核酸等温扩增反应的微芯片，该微芯片被构造成精确地控制核酸扩增反应的反应时间等。
技术介绍
迄今，聚合酶链反应(PCR)方法已经被用作一种核酸扩增方法。在PCR方法中，用作模板的核酸通过重复包括以下三个步骤的温度循环进行扩增(1)热变性；(2)退火；以及(3)伸长反应(elongation reaction)。步骤(1)中的热变性是将模板核酸链从双链离解成单链的步骤。热变性期间的反应温度通常为约94°C。步骤( 中的退火是将寡核苷酸引物结合至各自已被离解成单链的模板核苷酸链的步骤。退火期间的反应温度通常为约50°C 60°C。步骤(3)中的伸长反应是利用DNA聚合酶合成与相应单链互补的DNA分子的步骤，该合成从已结合寡核苷酸引物的部分开始。伸长反应期间的反应温度通常为约72°C。近来，一种称为等温扩增法的方法，其是一种不需要重复温度循环的更简单的方法，已被用作核酸扩增方法。例如，在环介导等温扩增(LAMP)方法中，通过混合模板核酸链与试剂如寡核苷酸引物、链置换DNA聚合酶和核酸单体，并在恒定温度(约65°C )下维持所得混合物而完成反应。因此，根据这种LAMP方法，能够在一个步骤中扩增核酸。与本专利技术相关的，近来，已经开发了核酸扩增装置(例如实时PCR装置)，其中核酸扩增反应在微芯片的孔中实施，并且扩增的核酸链进行光学检测或定量。日本未审查专利申请公开No. 2007-43998披露了一种微流体芯片，其中将寡核酸引物、底物、酶和核酸扩增反应所需的其他试剂以固体状态置于通道(channel)中。在这种微流体芯片中，当反应所需的其他试剂以液体状态送到通道时，液体状态的试剂和固体状态的试剂彼此接触并且固体状态的试剂溶解，由此开始该反应。
技术实现思路
在PCR方法中，采用一种称为“热启动法(hot-start method) ”的方法以便严格控制反应时间。该热启动法是这样的一种方法，其中防止了由于寡核苷酸引物的误退火(misarmealing)导致的非特异性扩增反应，并获得期望的扩增产物的方法。通过将包含靶核酸链和不同于DNA聚合酶的试剂的混合液体加热至寡核苷酸引物的变性温度 (denaturation temperature)、在该变性温度下加入酶、然后实施温度循环来实现该热启动法。相反，在等温扩增方法中，由于反应在恒温下在一个步骤中执行，所以不会使用热启动法。因此，反应在试剂和模板核酸链进行混合时的时间逐步进行，并因此很难严格控制反应时间。迄今，在微芯片型核酸扩增装置中，采用了这样的方法，其中试剂和模板核酸链预先混合，然后将所得混合液体引入到微芯片的孔中而执行反应。因此，反应可以在制备混合液体期间或将混合液体引入到孔中的期间在混合液体中进行。因此，很难严格控制反应时间，导致产生在扩增的核酸链的定量方面的问题。期望提供一种用于在等温扩增方法中精确控制反应时间的技术。根据本专利技术的一个实施方式，提供了一种用于核酸等温扩增反应的微芯片，其中对于核酸的等温扩增反应所需的物质中的至少一种(或至少一部分)存在于充当反应的反应场所的反应区中，该物质中的至少一种利用在高于室温(常温，room temperature)且低于反应的反应温度的温度下发生熔化的薄膜覆盖。在用于核酸等温扩增反应的微芯片中，反应所需的其他物质(remaining substance)中的至少一种优选固定在覆盖反应所需的物质中的至少一种的薄膜上。在用于核酸等温扩增反应的微芯片中，在反应区中存在的物质中的至少一种可以是选自寡核苷酸引物、酶和核酸单体中的至少一种。在用于核酸等温扩增反应的这种微芯片中，在包含其他物质和靶核酸链的样品溶液供应到反应区之后，通过加热覆盖预先置于反应区中的物质中的至少一种的薄膜而熔化该薄膜，反应能够在任意定时(timing，时刻)下开始。在用于核酸等温扩增反应的微芯片中，寡核苷酸引物优选固定在覆盖酶的薄膜上。在用于核酸等温扩增反应的微芯片中，薄膜优选通过蒸着(蒸镀，evaporation) 硬脂酸或固体石蜡而形成。用于核酸等温扩增反应的微芯片优选包括将液体从外部引入到其内的进口、多个反应区、以及构造成将从进口引入的液体供应到(各个)反应区的通道。根据本专利技术的另一个实施方式，提供了一种制造用于核酸等温扩增反应的微芯片的方法，该方法包括利用在高于室温且低于反应的反应温度的温度下发生熔化的薄膜覆盖对于核酸的等温扩增反应所需的物质中的至少一种，该物质中的至少一种被置于充当反应的反应场所的反应区中。根据本专利技术的另一个实施方式，提供了一种核酸等温扩增方法，包括，在存在对于核酸的等温扩增反应所需的物质中的至少一种的反应区中，该物质中的至少一种利用在高于室温且低于反应的反应温度的温度下发生熔化的薄膜覆盖，引入对于反应所需的其他物质；以及将温度升高至反应温度。在本专利技术的实施方式中，“核酸等温扩增反应”包括不涉及温度循环的各种扩增反应。等温扩增反应的实例包括环介导等温扩增(LAMP)方法、Smart扩增过程(SMAP)、基于核酸序列的扩增(NASBA)方法、等温的且嵌合引物引发的核酸扩增(ICAN)方法(注册商标)、转录逆转录协同(TRC)方法、链置换扩增(SDA)方法、转录介导扩增(TMA)方法、以及滚环扩增(RCA)方法。另外，“核酸扩增反应”广泛包括用于核酸扩增目的的在恒温下的核酸扩增反应。除了核酸链的扩增外，这些核酸扩增反应还包括涉及扩增的核酸链的定量确定的反应，例如实时(RT)-LAMP方法。“对于反应所需的物质”是指对于在核酸等温扩增反应中获得扩增的核酸链所需的物质。这些物质的具体实例包括各自具有与靶核苷酸链互补的碱基序列的寡核苷酸引物、核酸单体(脱氧核苷-三磷酸(dNTP))、酶以及反应缓冲液的溶质(溶解物，solute)。根据本专利技术的实施方式，提供了一种用于在等温扩增方法中精确控制反应时间的技术。附图说明图1是根据本专利技术实施方式的用于核酸扩增反应的一种微芯片的示意性俯视图；图2是微芯片的示意性剖视图(即，沿图1的线II-II截取的剖视图)；图3A 3C是示出了对于反应所需的物质的示意图，这些物质存在于微芯片的孔中；图4是示出了根据本专利技术实施方式的一种制造用于核酸扩增反应的微芯片的方法的流程图；图5A 5C是示出了对于反应所需的物质的示意图，这些物质存在于根据一种变形的微芯片的孔中；图6是示出了根据一种变形的制造用于核酸扩增反应的微芯片的方法的流程图；图7是示出了在引物通过利用硬脂酸或固体石蜡覆盖而被固定的反应系统中的 LAMP反应的结果(实施例2)的图示；以及图8是示出了在酶通过用硬脂酸或固体石蜡覆盖而被固定的反应系统中的LAMP 反应的结果(实施例2)的图示。具体实施例方式现在将参考附图描述实现本专利技术的实施方式。以下描述的实施方式仅举例说明了本专利技术的典型实施方式的实例，而本专利技术的范围不由这些实施方式狭窄地进行解释。1、用于核酸等温扩增反应的微芯片和核酸等温扩增方法本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种用于核酸等温扩增反应的微芯片，其中，对于核酸的等温扩增反应所需的物质中的至少一种存在于充当所述反应的反应场所的反应区中，所述物质中的至少一种利用在高于室温且低于所述反应的反应温度的温度下发生熔化的薄膜覆盖。

【技术特征摘要】
2010.06.22 JP 2010-141318;2010.09.01 JP 2010-195781.一种用于核酸等温扩增反应的微芯片，其中，对于核酸的等温扩增反应所需的物质中的至少一种存在于充当所述反应的反应场所的反应区中，所述物质中的至少一种利用在高于室温且低于所述反应的反应温度的温度下发生熔化的薄膜覆盖。2.根据权利要求1所述的微芯片，其中，所述反应所需的其他物质中的至少一种固定在覆盖所述反应所需的物质中的至少一种的所述薄膜上。3.根据权利要求1所述的微芯片，其中，所述薄膜通过蒸着硬脂酸或固体石蜡而形成。4.根据权利要求3所述的微芯片，其中，所述反应区中存在的所述物质中的至少一种是选自寡核苷酸引物、酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：小岛健介，世取山翼，中村友彦，渡边英俊，濑川雄司，
申请(专利权)人：索尼公司，
类型：发明
国别省市：JP