【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种。
技术介绍
现有猪蓝耳病病毒核酸的检测方法有抗体检测和抗原检测。抗体检测往往滞后于抗原检测，从而不能及时准确的快速发现疫病，导致疫病的爆发流行，造成巨大的经济损失；现有抗原检测方法中病毒分离时间长、环境设施要求高，技术水平要求高，而农村及边远地区广大中小养殖户乃至大中型养殖场由于环境设施和人员技术不合要，预警或可疑标本只能送到大型检测中心检测；而且其灵敏度不高；并且存在如何保存RNA不降解，一直是分子生物学领域的难题，迄今没有简便可行的保存方法；传统方法运输和储存这些病毒标本是需要专业的冰冻和运输技术的，这种方法成本高而且需要一定的专业知识，不易推广， 从而不能及时和准确地发现疫病。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种。以实现现采样、运输和储存方便可行，操作步骤简单快捷，检测灵敏、准确。，包括以下步骤 (一)样品采集和处理(1)点样将采集的80-100U1动物血液样品滴加至FTA卡样品区内，自然干燥1小时，于阴凉干燥处储存0-9天。(2)取样用打孔器将FTA样品区整个样品盘打下，把样品盘放入聚合酶链式反应扩增管中；(3)孵育加入400μ L核糖核酸处理缓冲液(IOmM三羟甲基氨基甲烷_HC1，ρΗ 8. 0，0. ImM EDTA, 200 μ g/mL糖原和2mM 二硫苏糖醇)，并上下吹打两次，盖上盖子，在冰上孵育15分钟，每5分钟混合一次；(4)纯化加入40ul3M的乙酸钠(pH5. 2)和400ul冰预冷的异丙醇，从洗涤溶液中沉淀核糖核酸RNA，在-20°C下孵育1小时；把管放置在微量离心管内，在12，000转/分条件下...
【技术保护点】
１．一步法检测猪蓝耳病病毒核酸的方法，包括样品采集和处理和检测，其特征在于，所述样品采集将８０－１００ｕｌ动物血液样品滴加至ＦＴＡ卡样品区内；所述检测包括（１）设计针对通用型猪蓝耳病病毒的特异性引物和探针，并在探针上标记好ＦＡＭ和ＴＡＭＡＲＡ荧光基团：所述特异性引物是上游引物序列５’ＧＧＣＡＡＡＴＧＡＴＡＡＣＣＡＣＧＣＡ ３’；下游引物序列５’ ＧＣＡＴＡＴＴＴＧＡＣＡＡＧＧＴＴＴＡＣＣＡＣＴ ３’；所述探针序列是５’ ＣＧＧＣＧＣＣＡＣＧＡＣＧＧＴＣＡＡＣＧ ３’， 在其５’端标记ＦＡＭ荧光基团，在其３’端标记ＴＡＭＡＲＡ淬灭基团； （２）配制和优化检测体系和反应条件，反应体系为２５或５０ｕｌ的三羟甲基氨基甲烷－ＨＣｌ（ｐＨ７．８－９．０），上下游引物各０．１－０．５ｕＭ，脱氧核苷酸混合物各１００－４００ｕＭ， 探针０．１－０．５ｕＭ，莫洛尼小鼠白血病病毒反转录酶１００－３００Ｕ，热稳定性的ＤＮＡ 聚合酶１－５Ｕ，Ｍｇ２＋－４－８Ｍ，均一化参比染料ＲＯＸ３００－５００ｎＭ，每反应加入前述重悬在三羟甲基氨基甲烷－ＥＤＴＡＥ缓冲液中样本１－１５ｕｌ。
【技术特征摘要】
1.一步法检测猪蓝耳病病毒核酸的方法，包括样品采集和处理和检测，其特征在于，所述样品采集将80-100U1动物血液样品滴加至FTA卡样品区内；所述检测包括(1)设计针对通用型猪蓝耳病病毒的特异性引物和探针，并在探针上标记好FAM和 TAMARA荧光基团所述特异性引物是上游引物序列5’GGCAAATGATAACCACGCA 3’;下游引物序列 5，GCATATTTGACAAGGTTTACCACT 3，；所述探针序列是 5，CGGCGCCACGACGGTCAACG 3，， 在其5’端标记FAM荧光基团，在其3’端标记TAMARA淬灭基团；(2)配制和优化检测体系和反应条件，反应体系为25或50ul的三羟甲基氨基甲烷-HCl (ρΗ7· 8-9. 0)，上下游引物各0. 1-0. 5uM,脱氧核苷酸混合物各100_400uM， 探针0.1-0. 5uM，莫洛尼小鼠白血病病毒反转录酶100-300U，热稳定性的DNA聚合酶 1-5U, Mg2+_4-8M，均一化参比染料R0X300-500nM，每反应加入前述重悬在三羟甲基氨基甲烷-EDTAE缓冲液中样本l_15ul。2.根据权利要求1所述的一步法检测猪蓝耳病病毒核酸的方法，其特征在于，所述样品的处理包括以下步骤(1)...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘东波，张柳莹，王睿，
申请(专利权)人：湖南农安生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：43
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