本发明专利技术公开了检测牛肠道病毒和口蹄疫病毒的核苷酸序列，该检测牛肠道病毒和口蹄疫病毒的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1至SEQIDNO：4，其中序列SEQIDNO：1和SEQIDNO：2分别为检测牛肠道病毒的正义引物和反义引物，序列SEQIDNO：3和SEQIDNO：4分别为检测口蹄疫病毒的正义引物和反义引物。本发明专利技术进一步公开了含有上述引物的检测牛肠道病毒和口蹄疫病毒的试剂盒。本发明专利技术所述的试剂盒具有快速、灵敏、特异、稳定、重复性好的特点。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及检测牛肠道病毒和口蹄疫病毒的核苷酸序列和检测试剂盒，尤指多重 RT-PCR检测牛肠道病毒和口蹄疫病毒的检测核苷酸序列和试剂盒，不仅适用于对动物组织样本的准确检测，还可适用于动物活体样本(咽喉拭子、肛门拭子、粪便、血清、疱疹皮、疱疹液、眼结膜分泌物等)的检测，可用于牛肠道病毒的国内筛查和出入境检疫，以及牛肠道病毒和口蹄疫病毒的同时检测和鉴别诊断等，属于动物疫病检测、检验检疫领域。
技术介绍
牛肠道病毒和口蹄疫病毒都是小RNA病毒科成员。小RNA病毒是一个极为繁杂的病毒科，可分为鼻病毒属、口蹄疫病毒属、肠道病毒属、心病毒属和甲肝病毒属等5个属，共 200多种病毒，能引起人和动物的多种疾病，如甲肝、口蹄疫等，在医学和兽医学研究中均具有重大意义。肠道病毒是脊椎动物肠道中原有的栖居者，病原性不明显，通常引起轻度或不显性感染，但常因侵犯其他器官而引起各种临床综合征，或者在一定条件下引发显著症状，例如牛肠道病毒、猪肠道病毒、禽肠道病毒、人肠道病毒等等。2005年初北京的牛场中发生牛肠道病毒感染，严重影响了畜牧业生产。部分牛场的产奶牛普遍(约80%)出现了严重腹泻症状水样腹泻，有泡沫，少数(10-15%)严重的还有鲜血，体温变化不明显，食欲下降，基本没有死亡，但产奶量大幅下降(约30%)。约两周后康复，康复后大多数奶牛的产奶量不能恢复到病前的水平，特别是日产35千克以上高产奶牛。严重降低了生产性能，并且还有污染奶制品的可能。据跟踪调查，该病两年发生一次。 我们在发病的牛场中已经分离到了牛肠道病毒。随着猪链球菌2型病和高致病性蓝耳病的相继爆发，条件性致病菌/病毒对畜牧业生产和公共卫生安全方面的威胁，或者说潜在的危险也逐渐为人们所认识。因此我们认为随着人们对牛肠道病毒认识的加深和对公共卫生安全的重视日益加强，牛肠道病毒很有可能在将来被列为法检项目，在这种情况下我们提前针对牛肠道病毒建立快速、准确、敏感的诊断方法，进行技术储备显得格外重要，因此开展了牛肠道病毒快速检测技术研究。口蹄疫病毒可以感染偶蹄动物引起急性、热性、接触性传染病，最易感染的动物是黄牛、水牛、猪、骆驼、羊、鹿等，黄羊、麝、野猪、野牛等野生动物也易感染此病。本病以牛最易感染，羊的感染率低。口蹄疫在亚洲、非洲和中东以及南美均有流行，在非流行区也有散发病例。口蹄疫发病后一般不致死，但会使病兽的口、蹄部出现大量水疱，高烧不退，使实际畜产量锐减。另外，有个别口蹄疫病毒的变种可传染给人。因此，每次爆发后只能屠宰和集体焚毁染病牲畜以绝后患。由于口蹄疫传播迅速、难于防治、补救措施少，被称为畜牧业的 “头号杀手”。牛肠道病毒与口蹄疫病毒同属于小RNA病毒科成员，在形态结构、化学组成、部分理化性质和对环境的抵抗力方面有很多相近之处，而国外研究报道了多起牛肠道病毒与口蹄疫病毒同时分离到的病例，因此针对牛肠道病毒和口蹄疫病毒建立鉴别诊断方法也具有重大意义。在检验检疫过程中，快速、准确、敏感的诊断是检测疫病的关键所在。多重PCR可以同时区别鉴定两种或两种以上的病原，操作也比较简单易行，具有高效性、系统性和经济简便性等特点，适用于多种病原的鉴别诊断。因此我们针对牛肠道病毒基因和口蹄疫病毒基因建立多重RT-PCR快速检测技术，用于牛肠道病毒和口蹄疫病毒的鉴别诊断。这种检测方法的建立将为我国出入境牛肠道病毒和口蹄疫病毒的检验检疫奠定良好的技术基础，可在各口岸和各养殖企业推广应用，以及时检出牛肠道病毒和口蹄疫病毒，保障公共卫生安全，保障我国牛及其产品进出口贸易的正常进行，推动外贸经济的发展。一般PCR仅应用一对引物，通过 PCR扩增产生一个核酸片段，主要用于单一致病因子等的鉴定。多重PCR(multiplex PCR)，又称多重引物PCR或复合PCR，它是在同一 PCR反应体系里加上两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应，其反应原理，反应试剂和操作过程与一般PCR相同。多重PCR的用途主要有两方面1、多种病原微生物的同时检测或鉴定；2、病原微生物、某些遗传病及癌基因的分型鉴定。多种病原微生物的同时检测或鉴定，是在同一 PCR 反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行PCR扩增。可用于同时检测多种病原体或鉴定出是那一型病原体感染，可系统组合的有①肝炎病毒的感染，在同一病人或同一供血者体内，有时存在多种肝炎病毒重叠感染，有时是甲乙丙型肝炎病毒重叠；有时可能是甲乙型肝炎病毒重叠；有时是乙丙型肝炎病毒重叠。②肠道致病性细菌的检测，如伤寒，痢疾和霍乱，有时具有较相同的肠道症状，有时痢疾霍乱同存一病人并同时发病。③性病的检测，如梅毒，淋病及艾滋病的诊断。④战伤细菌及生物战剂细菌的检测，如破伤风杆菌，产气荚膜杆菌，炭疽杆菌，鼠疫杆菌等侦检。⑤需特殊培养的无芽胞厌氧菌，如脆弱类杆菌、艰难杆菌的鉴定等。某些病原微生物，某些遗传病或癌基因，型别较多，或突变或缺失存在多个好发部位，多重PCR可提高其检出率并同时鉴定其型别及突变等可系统应用的有乙型肝炎病毒的分型；乳头瘤病毒的分型；单纯疱疹病毒的分型；杜氏肌营养不良症的分型及癌基因的检测等。多重PCR的特点有1、高效性，它是在同一PCR反应管中同时加上多种病原微生物的特异性引物，进行PCR扩增，可用于同时检测多种病原体或鉴定出是哪一型病原体感染； 2、系统性，多重PCR很适宜于成组病原体的检测，如肝炎病毒、肠道致病性细菌等的同时侦检；3、经济简便性，多种病原体在同一反应管内同时检出，大大的节省时间，节省试剂，节约经费开支，为临床提供更多更准确的诊断信息。因此近年来，多重PCR在兽医诊断、检测领域得到了大量应用。本专利技术首次将多重PCR技术应用于牛肠道病毒和口蹄疫病毒的同时检测和鉴别诊断领域，提供了针对牛肠道病毒和口蹄疫病毒的特异性引物序列、试剂盒和检测方法。
技术实现思路
本专利技术的第一个目的是提供一组特异性强、灵敏度高的同时鉴别、检测牛肠道病毒和口蹄疫病毒的核苷酸序列，包括2对引物序列。本专利技术的第二个目的是提供快速、准确、使用方便的同时鉴别、检测牛肠道病毒和口蹄疫病毒的多重PCR检测试剂盒。为实现上述目的，本专利技术采用以下技术方案 选择牛肠道病毒和口蹄疫病毒5’ -非编码区基因序列作为靶区域，在多重序列比对的基础上，进行引物设计。引物长度为20个碱基左右，GC含量为50%—60%，引物内无二级结构和重复性，引物间和引物内无互补序列，引物间的熔解温度(Tm值)相差小于5°C。一组检测牛肠道病毒的核苷酸序列，如下1)5，-GGG GAG TAG TCC GAC TCC GC—3，(SEQ ID NO 1)2)5，- CRG AGC TAC CAC YGG GDff TGT GG -3，(SEQ ID NO 2)R代表嘌呤，此处为A或G ;Y代表嘧啶，此处为T或C ;D代表A或G或T ； W代表A或T ；一组检测口蹄疫病毒的核苷酸序列，如下3)5，-GCC TGG TCT TTC CAG GTC T -3，(SEQ ID NO 3)4)5，- CCA GTC CCC TTC TCA GAT C -3，(SEQ ID NO 4)其中序列1)和2)分别为检测牛肠道病毒的正义引物和反义引物，序列3)和4)分别为检测口蹄疫病毒的正义引物和反义本文档来自技高网...
【技术保护点】
１．一组检测牛肠道病毒和口蹄疫病毒的核苷酸序列，其特征在于，其核苷酸序列如序列表ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１至ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４，其中序列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２分别为检测牛肠道病毒的正义引物和反义引物；序列ＳＥＱ ＩＤＮＯ：３和ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４分别为检测口蹄疫病毒的正义引物和反义引物。
【技术特征摘要】
1.一组检测牛肠道病毒和口蹄疫病毒的核苷酸序列，其特征在于，其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO :1至SEQ ID NO :4，其中序列SEQ ID NO 1和SEQ ID NO 2分别为检测牛肠道病毒的正义引物和反义引物；序列SEQ ID NO :3和SEQ ID NO :4分别为检测口蹄疫病毒的正义引物和反义引物。2.一种检测牛肠道病毒和口蹄疫的检测试剂盒，其特征在于，由以下组分组成1)裂解液；2)RT-PCR反应液，包括PCR缓冲液、RT缓冲液、MgCL2、dNTP、牛肠道病毒正义引物、牛肠道病毒反义引物、口蹄疫病毒正义引物、口蹄疫病毒反义引物；3)反转录酶M-MLV；4)Taq DNA聚合酶；5)DEPC 水；6)阴性对照牛肠道病毒和口蹄疫病毒阴性组织样品，用0.01mol/L pH7. 2 PBS缓冲盐水制成20%悬液，70°C作用1小时；7)牛肠道病毒阳性对照为体外转录的非感染性RNA片段，其对应的DNA序列为序列表SEQ ID No. 5所示的核苷酸序列；8)口蹄疫病毒阳性对照为体外转录的非感染性RNA片段，其对应的DNA序列为序列表SEQ ID No. 6所示的核苷酸序列；其中，牛肠道病毒正义引物为序列表SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列，牛肠道病毒反义引物为序列表SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列，口蹄疫病毒正义引物为序列表SEQ ID No. 3 所示的核苷酸序列，口蹄疫病毒反义引物为序列表SEQ ID No. 4所示的核苷酸序列。3.根据权利要求2所述的检测牛肠道病毒和口蹄疫病毒的检测试剂盒，其特征在于， 所...
【专利技术属性】
技术研发人员：吴丹，张鹤晓，吴涛，高志强，周琦，刘来福，蒲静，张伟，汪琳，谷强，张向东，乔彩霞，柏亚铎，段向英，齐玮，郭铮蕾，
申请(专利权)人：中华人民共和国北京出入境检验检疫局，
类型：发明
国别省市：11
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