用于检测乙型肝炎病毒耐药突变位点的引物及方法技术

本发明专利技术公开了一种用于检测乙型肝炎病毒耐药突变位点的引物及方法。本发明专利技术提供了用于乙型肝炎病毒耐药突变位点检测的4对PCR引物，以这4对PCR引物扩增乙型肝炎病毒基因组DNA，获得的4个片段以重叠的方式覆盖整个乙型肝炎病毒逆转录酶基因序列。本发明专利技术将4段PCR片段以等摩尔比混合制成逆转录酶基因文库，经454高通量测序和生物信息学分析，能够检测乙型肝炎患者血清样本中的乙型肝炎病毒是否含有耐药性突变位点。本发明专利技术能够检测到患者血清中占1%以上的乙型肝炎病毒耐药突变，具有敏感性高、操作简单、通量大等优点，一次测序可以进行多个样本耐药突变位点的分析。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及乙型肝炎病毒耐药突变位点的检测，尤其是一种利用妨4测序技术对乙型肝炎病毒耐药突变位点进行检测，属于医学检测

技术介绍
乙型肝炎病毒(HBV)简称乙肝病毒，是一种DNA病毒，属于嗜肝DNA病毒科。根据目前所知，乙肝病毒只对人和猩猩有易感性，引发乙型病毒性肝炎疾病。完整的乙型肝炎病毒成颗粒状，直径为42纳米，是英国科学家Dane于1970年首先发现，故又称Dane颗粒(丹氏颗粒)。Dane颗粒由外膜和内核两部分组成，外膜厚7纳米，由蛋白质和膜脂质组成，称作乙肝病毒表面抗原(HBsAg)。中心部分的直径约观纳米，为病毒的核心，其中包括核心抗原(HBcAg)，病毒基因组DNA和合成病毒基因组的DNA多聚酶。乙肝病毒基因组编码四个基因，分别是表面抗原基因(S、PreSl及ft~eS2基因)，DNA多聚酶基因(P基因)，X蛋白基因，核心抗原基因(C及基因)。乙肝病毒感染是一个严重的公共卫生问题。全球60 亿人口中，约20亿人曾感染过乙肝病毒，其中3. 5 4亿人为慢性乙肝病毒感染，约占全球人口 6%。在这3. 5 4亿慢性乙肝病毒感染者中，约15% 25%最终将死于与乙肝病毒感染相关的肝病。而我国属于高流行区，根据2002年全国乙型肝炎血清流行病学调查表明，我国一般人群中HBsAg流行率为9. 09%，估计约1.2 1.3亿人为慢性乙肝病毒感染， 占全世界慢性乙肝病毒感染者的1/3，全国每年死于与乙肝相关肝病约30万例。目前广泛应用于临床乙肝病毒抗病毒治疗的药物是核苷类似物药物。由于乙型肝炎病毒(HBV)在复制的逆转录过程中，逆转录酶缺乏严格的校正机制，复制过程中自发突变率达10-5，导致乙型肝炎病毒的基因极易发生突变。当基因突变是发生在HBV逆转录酶 (reverse transcriptase，RT)基因的特定位点的特定种类的突变，就会产生对核苷类似物药物的耐药。目前已经鉴定的与耐药相关的逆转录酶基因突变为L80V/I，I169T，V173L， L180M, A181TV, T184S/A/I/L/F/G, A194T, S202G/I, M204V/I/S, N236T, M250V, Q215S, V84M, S85A和V214A。数字代表突变在逆转录酶基因上的位置。慢性乙型肝炎患者抗病毒治疗过程中发生病毒耐药突变是限制核苷类似药物治疗的一个主要障碍，随着治疗时间的延长， 抗病毒药物治疗的患者体内可出现变异株，从而发生病毒学突破，导致治疗失败。一些病毒发生的耐药变异已被证实可以引起对几种药物的交叉耐药，这就限制了对患者的进一步长期有效地治疗。因此在治疗中早期检测出这些变异，对选择药物、指导远期治疗非常必要，对大幅度提高抗病毒治疗的疗效具有重要的意义。目前用于检测HBV耐药突变位点的方法主要有以下三种(1)聚合酶链扩增产物直接测序(Sanger测序)聚合酶链扩增(PCR)产物直接测序被认为是药物治疗过程中耐药检测的首选方法。该方法简明，易操作，但是灵敏性不高，只有当变异株超过HBV准种池(quasispecies pool)的20%以上直接测序才能检测到。(2)聚合酶链反应-限制性片段长度多态性分析(PCR-RFLP)通过PCR扩增出目标基因片段，然后用给定的限制性内切酶进行酶切，根据酶切图谱进行突变位点的分析。该方法可以检测到病毒准种池中5%的变异株，但只能检测单位点变异，仅适用于少数耐药突变位点的检测。(3)反向杂交线性探针技术(LiPA)将一系列寡聚核苷酸探针固定在一条杂交膜上，将地高辛标记的PCR产物与相应的探针结合，通过碱性磷酸酶检测系统来观察杂交结果。该方法可以检测到病毒准种池中5%的变异株，但对新出现的变异都要设计新的探针， 迫使该技术要定期进行更新。另外由于核苷酸序列上基因型的不同，为了检测一个氨基酸置换通常需要许多个探针来检测。Roche公司的妨4测序技术是一种基于焦磷酸测序原理而建立起来的高通量测序系统。依靠生物发光进行DNA序列分析的新技术；在DNA聚合酶，ATP硫酸化酶，荧光素酶和双磷酸酶的协同作用下，将引物上每一个dNTP的聚合与一次荧光信号释放偶联起来。 通过检测荧光信号释放的有无和强度，就可以达到实时测定DNA序列的目的。与其他高通量测序方法相比，4M测序技术具有测序速度快，单个序列读长长，准确度高，一致性好的优点，目前被广泛应用于基因组及转录组的测序中。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是第一个目的是提供一种用于乙型肝炎病毒耐药突变位点检测的引物。第二个目的是用上述引物检测乙型肝炎病毒耐药突变位点的方法，该方法操作简单，一次测序可以进行多个样本耐药突变位点的分析。本专利技术解决其技术问题采用以下的技术方案本专利技术是根据基因库中能够检索到的乙型肝炎病毒基因组核苷酸序列进行同源性分析，设计以下用于检测乙型肝炎病毒耐药突变位点的四对引物 第一对是Fl片段的引物Flf和Flr，其中 Flf的序列为CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAGTGCGTCTGCTGGTGGCTCCAGTTC Flr的序列为CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGTGCGTACAAACGGGCAACATACCTTG 第二对是F2片段的引物F2f和F2r，其中 F2f的序列为CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAGTGCGTATCGCTGGATGTGTCTGCGG F2r的序列为CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGTGCGTTGTACAGACTTGGCCCCCAA 第三对是F3片段的引物F3f和F3r，其中 F3f的序列为CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAGTGCGTCTTTCCCCCACTGTYTGGC F3r的序列为CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGTGCGTTTGGCGAGAAAGTRAAAGCCTG 第四对是F4片段的引物F4f和F4r，其中 F4f的序列为CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAGTGCGTAAYAGRCCTATTGATTGGAAAGTF4r的序列为CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGTGCGTCYAGGAGTTCCGCAGTATGG。本专利技术提供的用于检测乙型肝炎病毒耐药突变位点的方法，该方法是采用上述的引物，通过PCR获得4段PCR产物，这4段PCR产物以重叠的方式覆盖全部逆转录酶基因序列，将4段PCR产物等摩尔比混合构建样本的逆转录酶基因文库，再用4M测序技术对该文库进行检测，从而确定样本中是否含有耐药性突变位点。上述方法可以按下列步骤顺序进行a.提取患者血清中乙型肝炎病毒DNA；b.PCR反应以步骤a中提取的DNA为模版，分别用Fl片段的引物Flf和Flr，F2片段的引物F2f 和F2r，F3片段的引物F3f和F3r，F4片段的引物F4f和F4r进行PCR,在PCR管中加入下列物质=IOXPCR缓冲液5uL，四种脱氧核糖核苷酸1 uL，浓度为 20umol/L PCR 引物 f luL，浓度为 20umol/L PCR 引物 r luL，高保真DNA聚合酶 0. 5 uL，D本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．一种用于检测乙型肝炎病毒耐药突变位点的引物，其特征是根据基因库中能够检索到的乙型肝炎病毒基因组核苷酸序列进行同源性分析，设计以下四对引物：第一对是Ｆ１片段的引物Ｆ１ｆ和Ｆ１ｒ，其中：Ｆ１ｆ的序列为：ＣＧＴＡＴＣＧＣＣＴＣＣＣＴＣＧＣＧＣＣＡＴＣＡＧＡＣＧＡＧＴＧＣＧＴＣＴＧＣＴＧＧＴＧＧＣＴＣＣＡＧＴＴＣＦ１ｒ的序列为：ＣＴＡＴＧＣＧＣＣＴＴＧＣＣＡＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＡＣＧＡＧＴＧＣＧＴＡＣＡＡＡＣＧＧＧＣＡＡＣＡＴＡＣＣＴＴＧ第二对是Ｆ２片段的引物Ｆ２ｆ和Ｆ２ｒ，其中：Ｆ２ｆ的序列为：ＣＧＴＡＴＣＧＣＣＴＣＣＣＴＣＧＣＧＣＣＡＴＣＡＧＡＣＧＡＧＴＧＣＧＴＡＴＣＧＣＴＧＧＡＴＧＴＧＴＣＴＧＣＧＧＦ２ｒ的序列为：ＣＴＡＴＧＣＧＣＣＴＴＧＣＣＡＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＡＣＧＡＧＴＧＣＧＴＴＧＴＡＣＡＧＡＣＴＴＧＧＣＣＣＣＣＡＡ第三对是Ｆ３片段的引物Ｆ３ｆ和Ｆ３ｒ，其中：Ｆ３ｆ的序列为：ＣＧＴＡＴＣＧＣＣＴＣＣＣＴＣＧＣＧＣＣＡＴＣＡＧＡＣＧＡＧＴＧＣＧＴＣＴＴＴＣＣＣＣＣＡＣＴＧＴＹＴＧＧＣＦ３ｒ的序列为：ＣＴＡＴＧＣＧＣＣＴＴＧＣＣＡＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＡＣＧＡＧＴＧＣＧＴＴＴＧＧＣＧＡＧＡＡＡＧＴＲＡＡＡＧＣＣＴＧ第四对是Ｆ４片段的引物Ｆ４ｆ和Ｆ４ｒ，其中：Ｆ４ｆ的序列为：ＣＧＴＡＴＣＧＣＣＴＣＣＣＴＣＧＣＧＣＣＡＴＣＡＧＡＣＧＡＧＴＧＣＧＴＡＡＹＡＧＲＣＣＴＡＴＴＧＡＴＴＧＧＡＡＡＧＴＦ４ｒ的序列为：ＣＴＡＴＧＣＧＣＣＴＴＧＣＣＡＧＣＣＣＧＣＴＣＡＧＡＣＧＡＧＴＧＣＧＴＣＹＡＧＧＡＧＴＴＣＣＧＣＡＧＴＡＴＧＧ。...

【技术特征摘要】
1.一种用于检测乙型肝炎病毒耐药突变位点的引物，其特征是根据基因库中能够检索到的乙型肝炎病毒基因组核苷酸序列进行同源性分析，设计以下四对引物第一对是Fl片段的引物Flf和Flr，其中 Flf的序列为CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAGTGCGTCTGCTGGTGGCTCCAGTTC Flr的序列为CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGTGCGTACAAACGGGCAACATACCTTG 第二对是F2片段的引物F2f和F2r，其中 F2f的序列为CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAGTGCGTATCGCTGGATGTGTCTGCGG F2r的序列为CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGTGCGTTGTACAGACTTGGCCCCCAA 第三对是F3片段的引物F3f和F3r，其中 F3f的序列为CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAGTGCGTCTTTCCCCCACTGTYTGGC F3r的序列为CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGTGCGTTTGGCGAGAAAGTRAAAGCCTG 第四对是F4片段的引物F4f和F4r，其中 F4f的序列为CGTATCGCCTCCCTCGCGCCATCAGACGAGTGCGTAAYAGRCCTATTGATTGGAAAGT F4r的序列为CTATGCGCCTTGCCAGCCCGCTCAGACGAGTGCGTCYAGGAGTTCCGCAGTATGG。2.一种用于检测乙型肝炎病毒耐药突变位点的方法，其特征是采用权利要求1所述的引物，通过PCR获得4段PCR产物，这4段PCR产物以重叠的方式覆盖全部逆转录酶基因序列，将4段PCR产物等摩尔比混合构建样本的逆转录酶基因文库，再用4M测序技术对该文库进行检测，从而确定样本中是否含有耐药性突变位...

【专利技术属性】
技术研发人员：尹飞飞，王华林，邓菲，胡志红，
申请(专利权)人：中国科学院武汉病毒研究所，
类型：发明
国别省市：83