猪蓝耳病病毒实时荧光反转录-聚合酶链式反应检测方法，其包括以下步骤：（1）设计针对猪蓝耳病病毒的的引物、探针，并在探针上标记好FAM和TAMARA荧光基团；（2）设计针对猪蓝耳病病毒靶序列的内标序列和内标探针，并在探针上标记好HEX和TAMARA荧光基团；（3）配制一步法反转录-聚合酶链式反应病毒核酸检测体系；（4）选定反应条件及程序，上机检测。本发明专利技术在一步法反转录-聚合酶链式反应体系内设置了阳性内对照（内标）,可有效监测待测样本中是否具有聚合酶链式反应抑制物，避免聚合酶链式反应假阴性。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种猪蓝耳病病毒检测方法，尤其是涉及一种带内标的猪蓝耳病病毒的实时荧光反转录-聚合酶链式反应检测方法。
技术介绍
传统猪蓝耳病病毒的检测方法有抗体检测法和抗原检测法两类。抗体检测往往滞后于抗原的检测，因而不能及时准确快速发现疫病，往往会导致疫病的爆发流行，造成巨大的经济损失。抗原检测，以往采用的病原体病毒分离方法，时间长，对环境设施要求高，对检测技术人员的技术熟练程度要求高，且基于免疫原理的抗原检测法存在灵敏度不高等问题。一步法反转录-聚合酶链式反应不断得到发展和改进，但检测结果容易出现假阴性而影响检测准确性的问题一直没有得到有效解决。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种可以避免出现假阴性结果的带内标的。本专利技术的目的是通过以下技术方案实现的研究表明，聚合酶链式反应检测结果出现假阴性的原因，是由于反应体系中存在抑制因素及其他相关因素，致使原来应该为阳性的结果却呈现阴性的现象。除抑制剂以外，其他相关因素主要有仪器故障、聚合酶链式反检测体系不恰当、DNA聚合酶失活以及人为操作失误等。在反转录-聚合酶链式反应体系中加入扩增阳性内对照即内标(即一段人工构建合成的DNA序列)能有效指示假阴性现象的出现，这段针对扩增片段人工合成的寡核苷酸， 碱基比与靶基因一致，只是排列序列不相同，与靶基因共用一对引物，探针序列不同。内标探针与HBV目标基因探针采用不同的荧光报告基团标记。本专利技术扩增内标作用的主要原理是将扩增内标添加到聚合酶链式反应体系中， 使之与目标基因序列共同进行扩增；如果在反应体系中存在一些抑制因素，则扩增内标和目的序列的扩增反应都将受到抑制，表明聚合酶链式反应假阴性。本专利技术之带内标的包括以下步骤(1)设计针对猪蓝耳病病毒的的引物、探针，并在探针上标记好FAM和TAMARA荧光基团；(2)设计针对猪蓝耳病病毒靶序列的内标序列和内标探针，并在探针上标记好HEX和 TAMARA荧光基团；(3)配制一步法反转录-聚合酶链式反应病毒核酸检测体系；(4)选定反应条件及程序，上机检测。优选的更具体的操作步骤是所述步骤(1)，设计针对通用型猪蓝耳病病毒的特异性引物和探针上游引物序列为 5，GGCAAATGATAACCACGCA 3，；下游引物为 5，GCATATTTGACAAGGTTTACCACT 3，；探针序列为 5，CGGCGCCACGACGGTCAACG 3 ’，5 ’端标记FAM荧光基团，3，端标记TAMARA淬灭基团。所述步骤0)，设计针对猪蓝耳病病毒靶序列的内标序列和内标探针，内标序列为 5’ ACCGCTGACCGCACTCGCGCAGCTCGATAGGTGCCCGGGTTGAAAAGCCTCGTGTTGGGTGG CAGAAAAGCTGTTAAGCAGGGAGTGGTAAACCTTGTCAAATATGCCAAATAA 3，；内标探针序列为 5，CGCTGACCGCACTCGCGCAGC 3，，5，端标记HEX荧光基团，3，端标记TAMARA淬灭基团。所述步骤(3)，所述一步法反转录-聚合酶链式反应病毒核酸检测体系为25#或 50 Pl的三羟甲基氨基甲烷-HCl (ρΗ7· 8-9. 0)，上下游引物各(0. 1-0. 5 μ\|)，脱氧核苷酸混合物各(100-400) _，探针(0. 1-0. 5) μ ，莫洛尼小鼠白血病病毒反转录酶(100-300U)， 热稳定性的DNA聚合酶(1-5U)，Mg2+ (4-8Μ)，均一化参比染料ROX (300-500ηΜ)，内标 (50-300IU/ml)，内标探针(0. 05-0. 2 μ ) ’总 RNA (lpg-Ι μ g)。(4)在实时荧光PCR检测仪ABI 7300上机检测，设置反应程序权利要求1.一种，其特征在于，包括以下步骤(1)设计针对猪蓝耳病病毒的的引物、探针，并在探针上标记好FAM和TAMARA荧光基团；(2)设计针对猪蓝耳病病毒靶序列的内标序列和内标探针，并在探针上标记好HEX和 TAMARA荧光基团；(3)配制一步法反转录-聚合酶链式反应病毒核酸检测体系；(4)选定反应条件及程序，上机检测。2.如权利要求1所述的，其特征在于，上游引物序列为5’ GGCAAATGATAACCACGCA 3’ ；下游引物5’ GCATATTTGACAAGGTTTACCACT 3，；探针序列 5，CGGCGCCACGACGGTCAACG 3，，5，端标记 FAM 荧光基团，3’端标记TAMARA淬灭基团。3.如权利要求1或2所述的，其特征在于，内标序列为 5，ACCGCTGACCGCACTCGCGCAGCTCGATA GGTGCCCGGGTTGAAAAGC CTCGTGTTGGGTGGCAGAAAAGCTGTTAAGCAGGGAGTGGTAAACCTTGTCAAATATGCCAAATAA 3’ ；内标探针序列为5，CGCTGACCGCACTCGCGCAGC 3，，5，端标记HEX荧光基团，3，端标记TAMARA淬灭基团。4.如权利要求1或2所述的，其特征在于，一步法反转录-聚合酶链式反应病毒核酸检测体系为25或5(^1的三羟甲基氨基甲烷-HC1，其pH(7.8-9.0)，上下游引物各(0. 1-0. 5 μ M),脱氧核苷酸混合物各(100-400 μ Μ),探针(0. 1-0. 5 μ Μ),莫洛尼小鼠白血病病毒反转录酶(50-300U)，热稳定性的 DNA 聚合酶(l-5U)，Mg2\4-8M)，均一化参比染料R0X(300-500nM)，内标(50-300IU/ ml)，内标探针(0. 05-0. 2 μ M)，总 RNA (lpg-Ι μ g)。5.如权利要求1或2所述的，其特征在于，所述检测是用荧光聚合酶链式反应检测仪 ABIM7300J机检测，设置反应程序为全文摘要，其包括以下步骤(1)设计针对猪蓝耳病病毒的的引物、探针，并在探针上标记好FAM和TAMARA荧光基团；(2)设计针对猪蓝耳病病毒靶序列的内标序列和内标探针，并在探针上标记好HEX和TAMARA荧光基团；(3)配制一步法反转录-聚合酶链式反应病毒核酸检测体系；(4)选定反应条件及程序，上机检测。本专利技术在一步法反转录-聚合酶链式反应体系内设置了阳性内对照(内标),可有效监测待测样本中是否具有聚合酶链式反应抑制物，避免聚合酶链式反应假阴性。文档编号G01N21/64GK102230024SQ20111015228公开日2011年11月2日 申请日期2011年6月8日 优先权日2011年6月8日专利技术者刘东波, 张柳莹, 王睿 申请人:湖南农安生物技术有限公司本文档来自技高网...
【技术保护点】
标记好ＨＥＸ和ＴＡＭＡＲＡ荧光基团；（３）配制一步法反转录－聚合酶链式反应病毒核酸检测体系；（４）选定反应条件及程序，上机检测。１．一种猪蓝耳病病毒实时荧光反转录－聚合酶链式反应检测方法，其特征在于， 包括以下步骤：（１）设计针对猪蓝耳病病毒的的引物、探针，并在探针上标记好ＦＡＭ和ＴＡＭＡＲＡ荧光基团；（２）设计针对猪蓝耳病病毒靶序列的内标序列和内标探针，并在探针上
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：刘东波，张柳莹，王睿，
申请(专利权)人：湖南农安生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：43
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。