本发明专利技术涉及一种病毒检测方法，更具体的讲是一种新城疫病毒核酸RT-PCR检测的方法，其包括病毒增殖、设计引物、提取核酸、产物鉴定、序列鉴定，本发明专利技术的有益效果是：本方法采用先接种鸡胚增殖病毒，而后进行PCR检测，通过将F-F引物中添加R简并引物，使得在进行检测的同时对弱病毒和强病毒进行检测，检测准确，并减少了分别对弱病毒和强病毒检测的时间，解决了传统方法中容易漏检的问题。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种病毒检测方法，更具体的讲是一种新城疫病毒核酸RT-PCR检测的方法。
技术介绍
新城疫((Newcastle disease, ND)是由新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV )引起禽的一种急性、烈性传染性疾病，给养禽业和珍禽业带来极大的经济损失。另外从多种野禽如麻雀、鸽、乌鸦等中也已分离出NDV。融合蛋白F是NDV感染细胞所必需的。病毒囊膜与靶细胞融合，使病毒进入细胞内进行复制，融合的过程就是靠F蛋白来实现。大量的研究表明，NDV的F蛋白F1/F2多肽裂解位点氨基酸的基序和NDV的毒力密切相关，其致病机理已通过反向遗传操作技术得以证实。F蛋白通常以无活性的H)前体形式存在，但 H)必须裂解成以二硫键连接的Fl和F2亚单位后，才使病毒具有感染性。F蛋白能否被裂解取决于病毒毒力的强弱和宿主细胞的特性。FO的裂解是病毒与细胞融合所必需的，也是病毒感染所必需的。强毒株的氨基酸基序为112R/K-R-Q-K/R-R_F117，弱毒株的基序为112G/E-K/R-Q-G/E-R-L117,两种情况都是在117位前裂解。对病毒的检测可以取内脏组织、泄殖腔和气管棉拭子或排泄物，但有些时候如对野禽和飞禽进行调查时则需取粪便进行检测。直接取粪便检测病毒核酸，相对省 时，但是由于样本中毒量较少，容易漏检。
技术实现思路
针对以上不足，本专利技术提供了一种新城疫病毒核酸RT-PCR检测的方法，本专利技术的方法是取待检禽的粪便，用灭菌生理盐水研磨成乳悬液，无菌处理后接种SPF鸡胚，收集鸡胚尿囊液，再提取其全基因组RNA，以RNA为模板，以F为靶基因的引物进行RT-PCR，随后对得到的产物进行电泳，根据电泳图谱分析被检禽粪便中是否感染有新城疫病毒，对目的片段进行测序可判断出新城疫病毒强弱毒株，不宜发生漏检现象。本专利技术是通过以下技术方案实现的一种新城疫病毒核酸RT-PCR检测的方法，包括以下步骤(O病毒增殖取需要检测的动物粪便，将质量比为1:3的动物粪便与生理盐水加入离心管中充分震荡形成混悬液，按每毫升混悬液加入青霉素和链霉素各1000单位，反应 4_6h后进行8000 g离心，取无菌上清液，将上清液经尿囊腔接种9-11日龄鸡胚，弃去24h 内死亡鸡胚，收取24h 96h的鸡胚尿囊液，_20°C备用；(2)设计引物参照GenBank中新城疫病毒的F基因序列，设计一对引物F-F和F-R， 用于扩增F基因，序列为F-F :5，-TCTGGAGGAAGGAGACARRRR-3，；所述R为简并引物，当R为A，扩增成功的是强毒株序列，当R为G时，扩增成功的是弱毒株序列。F-R :5’-GATCAGGCCGCTACCAATTAA-3’ ；扩增长度为483bp ；(3)提取核酸在1.5ml无RNA酶的离心管中加入200ul尿囊液和Iml的Trizol，充分混匀后在室温放置5分钟；加入O. 2 ml的氯仿，加盖好后剧烈震荡15秒，在室温放置2-3min，然后进行12000 g离心15 min，将水相转移到另一无RNA酶的离心管中，加入与水相等体积的异丙醇，室温静置10 min, 12000g离心15min,除去上层清液，向沉淀中加入Iml 75%乙醇洗涤RNA沉淀，混匀，12000 g离心5min，除去上层清液，超净台内风干RNA沉淀，加入IOul DEPC水充分溶解RNA;(4)RT-PCR反应的反应体系；2x Buffer25 μ I混合酶3 μ IF-F、F-R 引物(10 μ Μ)3μ IRNA 模板IOul (约 IOng-1 μ g)RNase-free ddH20补至 50 μ I。(5)扩征条件第一步50 min 50°C，I个循环；第二步94°C 3 min，I个循环；第三步 94°C1 min,52°C I min,72°C 2 min，35 个循环，第四步 72°C延伸 7min，I 个循环；(6)产物鉴定取5 L上述反应产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检验，以Marker DL2000作为参考，TAE缓冲液为电泳缓冲液，以5V/cm电泳lh，凝胶成像系统观察结果； (7)序列鉴定回收目的条带，16°C1.5 h连接至PMD19-T Easy Vector，转化感受态 DH5 α，均匀涂布于含Amp、IPTG和Χ-gal的LB固体培养基平板，37°C培养16h，挑取白色菌落小量培养，提取质粒作PCR扩增鉴定，将阳性菌液测序。本专利技术的有益效果是本方法采用先接种鸡胚增殖病毒，而后进行PCR检测，通过将F-F引物中添加R简并引物，使得在进行检测的同时对弱病毒和强病毒进行检测，检测准确，并减少了分别对弱病毒和强病毒检测的时间，解决了传统方法中容易漏检的问题。附图说明图1为本专利技术电泳结果示意图；图中1- Marker DL2000，2-强毒 NDV，3-弱毒株 NDV，4-水。具体实施方式下面结合附图和具体实施例对本专利技术做进一步说明，以便本领域技术人员可以更好的了解本专利技术，但并不因此限制本专利技术。一种新城疫病毒核酸RT-PCR检测的方法，包括以下步骤(O病毒增殖取需要检测的动物粪便，将质量比为1:3的动物粪便与生理盐水加入离心管中充分震荡形成混悬液，按每毫升混悬液加入青霉素和链霉素各1000单位，反应 4_6h后进行8000 g离心，取无菌上清液，将上清液经尿囊腔接种9-11日龄鸡胚，弃去24h 内死亡鸡胚，收取24h 96h的鸡胚尿囊液，_20°C备用；(2)设计引物参照GenBank中新城疫病毒的F基因序列，设计一对引物F-F和F-R， 用于扩增F基因，序列为F-F :5，-TCTGGAGGAAGGAGACARRRR-3，；所述R为简并引物，当R为A，扩增成功的是强毒株序列，当R为G时，扩增成功的是弱毒株序列。F-R :5，-GATCAGGCCGCTACCAATTAA-3，；引物F-F和F-R扩增长度为483bp(3)提取核酸在1.5ml无RNA酶的离心管中加入200ul尿囊液和Iml的Trizol，充分混匀后在室温放置5分钟；加入O. 2 ml的氯仿，加盖好后剧烈震荡15秒，在室温放置2-3min，然后进行12000 g离心15 min，将水相转移到另一无RNA酶的离心管中，加入与水相等体积的异丙醇，室温静置10 min, 12000g离心15min,除去上层清液，向沉淀中加入Iml 75%乙醇洗涤RNA沉淀，混匀，12000 g离心5min，除去上层清液，超净台内风干RNA沉淀，加入IOul DEPC水充分溶解RNA;(4)RT-PCR反应的反应体系；2x Buffer25 μ I混合酶3 μ IF-F、F-R 引物(10 μ Μ)3μ IRNA 模板IOul (IOng-1 μ g)RNase-free ddH20补至 50 μ I。(5)扩征条件第一步50 min 50°C，I个循环；第二步94°C 3 min，I个循环；第三步 94°C1 min,52°C I min,72°C 2 min，35 个循环，第四步 72°C延伸 7min，I 个循环； (6)产物鉴定取5 L上述反应产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检验，以Marker DL2000作为参考，TAE缓冲液为电泳本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种新城疫病毒核酸RT?PCR检测的方法，包括以下步骤：（1）病毒增殖：取需要检测的动物粪便，将质量比为1：3的动物粪便与生理盐水加入离心管中充分震荡形成混悬液，按每毫升混悬液加入青霉素和链霉素各1000单位，反应4?6h后进行8000?g离心，取无菌上清液，将上清液经尿囊腔接种9?11日龄鸡胚，弃去24h内死亡鸡胚，收取24h～96h的鸡胚尿囊液，?20℃备用；（2）设计引物：参照GenBank中新城疫病毒的F基因序列，设计一对引物F?F和F?R，用于扩增F基因，序列为：F?F：5“?TCTGGAGGAAGGAGACARRRR?3“；F?R：5“?GATCAGGCCGCTACCAATTAA?3“；扩增片段长度：483bp；（3）提取核酸：在1.5ml无RNA酶的离心管中加入200ul尿囊液和1ml的Trizol，充分混匀后在室温放置5分钟；加入0.2?ml的氯仿，加盖好后剧烈震荡15秒，在室温放置2?3min，然后进行12000?g离心15?min，将水相转移到另一无RNA酶的离心管中，加入与水相等体积的异丙醇，室温静置10?min，12000g离心15min，除去上层清液，向沉淀中加入1ml?75%乙醇洗涤RNA沉淀，混匀，12000?g离心5min，除去上层清液，超净台内风干RNA沉淀，加入10ul?DEPC水充分溶解RNA;（4）RT?PCR反应的反应体系：2x?Buffer????????????????25μl混合酶????????????????3μlF?F、F?R引物(10μM)???3μlRNA模板????????????10ulRNase?free?ddH2O???????补至50μl；（5）扩征条件：第一步50?min?50℃，1个循环；第二步94℃3?min，1个循环；第三步94℃1?min，52℃1?min，72℃2?min，35个循环，第四步72℃延伸7min，1个循环；（6）产物鉴定：取5??L上述反应产物进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检验，以DL2000的Marker作为参考，TAE缓冲液为电泳缓冲液，以5V/cm电泳1h，凝胶成像系统观察结果;（7）序列鉴定：回收目的条带，16℃?1.5?h连接至PMD19?T?Easy?Vector，转化感受态DH5α，均匀涂布于含Amp、IPTG和X?gal的LB固体培养基平板，37℃培养16h,挑取白色菌落小量培养，提取质粒作PCR扩增鉴定,将阳性菌液测序。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：袁小远，王友令，张玉霞，徐绍建，
申请(专利权)人：山东省农业科学院家禽研究所，
类型：发明
国别省市：
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