针对蛋白激酶基因的反义核酸的抑瘤作用制造技术

本发明专利技术阐述用化学方法合成一系列特异的反义寡核苷酸，其碱基排列顺序与人体内ＰＫＣ－α基因的一段序列互补。这些寡核苷酸可以在细胞内特异地与人体ＰＫＣ－α基因的信使核糖核酸（ｍＲＮＡ）杂交，从而阻止ＰＫＣ－α基因编码的ＰＫＣ激酶的表达，达到抑制肿瘤细胞生长的作用，这些反义寡核苷酸可用来发展成为抑制人体肿瘤生长的药物。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及抑制人体肿瘤细胞生长的寡核苷酸，具体地讲涉及抑制人体肿瘤细胞生长的针对PKC-α的反义寡聚脱氧核苷酸及含有所述寡核苷酸的组合物，以及将所述寡核苷酸用于制备抗肿瘤药物的用途。本专利技术所阐述的寡核苷酸，其碱基排列顺序与人体蛋白激酶C-同功酶(PKC-α)基因的一段序列互补，这些寡核苷酸可在细胞内特异地与人体PKC-α基因的信使核糖核酸(mRNA)杂交，从而阻止PKC-α基因编码的PKC-α激酶的表达，达到抑制肿瘤细胞生长的作用。蛋白激酶C基因家族至少由十个功能相关的同功酶组成，他们是一组丝氨酸-苏氨酸激酶，与细胞表面起始的信号传导过程有关(Nishizuka，Y.Science，258607-614，1992.Asaoka，Y.Trends Biochem.Sci.17414-417，1992)激活多种多样的细胞内应答。经典意义上的蛋白激酶C(α、βI、βII、γ)和新发现的蛋白激酶C(δ、ε、η、θ)由1，2-DAG(1，2-diacylglycerol)激活。而1，2-二酰基丙三醇由磷脂酶二酰基丙三醇酶解细胞膜磷脂而产生。磷脂酶是由很多生长因子和激素来调节的，因此，蛋白激酶C在调节正常细胞分化和增殖方面具有重要作用。研究结果亦证明PKC在(如发生于肿瘤发生和细胞癌化过程中)细胞异常增殖中的作用，这些结论主要由研究小鼠模型得来。如由phorobolester长期激活皮肤内的PKC基因表达导致角质化细胞快速生长，结果导致良性的鳞状上皮细胞癌。另外，由激活的V-rasHa转染的角质化细胞，转化表型过程中需要PKC的功能参与，说明原癌基因ras的一些作用需要PKC信号通道介导(Dlugosz，A.Cancer Res，546413-6420，1994)。在细胞株中稳定的过量表达不同亚型的PKC亦可引起不可调控的生长，正向和负向效应均有。例如将PKC-βI和PKC-γ转染成纤维细胞造成细胞生长速度加快，可不贴壁生长。而在大肠细胞株中表达PKC-β，则造成细胞生长抑制(Choi，P.L.Mol.Cell.Biol，104650-4657，1990)。在MCF-7乳腺癌细胞中过量表达的PKC-α导致产生一种侵润性更强的肿瘤类型，呈现更快的增殖速度，不贴壁生长，在裸鼠体内成瘤能力增强(Ways，D，K.J.Clin，invest，951906-1915，1995)，这些研究证实了不正常的PKC调控可对很多种细胞的生长转化造成深远影响。人类肿瘤的证据也表明PKC在一些肿瘤的生长过程中起重要作用。据报道，依肿瘤类型的不同，PKC表达水平有增有减(Aflalo，E，Int，J.Cancer，50136-141，1992)。一种理论认为，糖尿病性肥胖通过1，2-二酰基丙三醇激活PKC表达，而与大肠癌的发生相关。其过程是特异的细菌在肠腔中将脂转化为1，2-二酰基丙三醇，1，2-二酰基丙三醇进入大肠上皮，导致激活PKC基因的表达。这可以导致大肠组织细胞长期的增殖速度加快。(Weinstein，B.I.Cancer Res.51(suppl)5080s-5085s，1991)。以上关于PKC在肿瘤发生中所起作用的研究结果使人们设想将PKC基因作为发展肿瘤治疗用药的靶点。随后，为筛选发展该酶功能的抑制剂作出很多的努力。筛选出很多分子，其中大多数是作用于酶分子的活性部位或调节点位点，人们希望这些分子可以作为抗癌药物发挥与现存抗癌药不同的药物机理，希望这些分子可以产生细胞生长抑制而不产生细胞毒性，可是很大的不利点在于这些化合物虽然有时对PKC是特异的，但很少显示具有不同PKC亚型的选择能力。不同PKC亚型在肿瘤发生和生长调控方面的不同作用最近才开始被研究探索，结果揭示大多数PKC亚型同功酶在肿瘤发生过程中不起重要作用。因此，不加区分地抑制所有PKC同功酶的药物可能造成对与肿瘤发生无关的PKC同功酶的抑制，从而产生很多不希望产生的副反应。有一种特异抑制某种酶产生的手段是采用反义核酸来抑制其活性。反义核酸通过与互补的mRNA杂交，由很多种机制抑制mRNA表达蛋白质。因为反义核酸可特异性的结合目标的mRNA，可以设计出一种反义核酸来抑制与肿瘤发生有关的某一种PKC亚型同功酶的mRNA。高度的特异性选择亦可使之不产生目前其它药物所产生的副作用。本专利技术在培养细胞中筛选出对PKC-α特异的反义核酸，设计其结合于PKC-α亚型基因的mRNA的3’端非翻译区，显示出对PKC-αmRNA表达蛋白质的抑制，目前研究显示，其可抑制肿瘤生长。本专利技术的目的之一是提供一种反义寡聚脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)序列，其特征在于可特异性结合PKC-α基因mRNA的不同区域。本专利技术的另一目的是提供含有本专利技术寡核苷酸的药物组合物。本专利技术的另一目的是提供了本专利技术寡核苷酸用于制备抗肿瘤药物的用途。本专利技术设计了一系列可以结合于PKC-α基因的mRNA的不同区域的反义核酸分子，在培养细胞中筛选对PKC-α基因表达特异性抑制的反义核酸，培养细胞采用A549细胞设立阴性对照P23一个，阳性对照Pac14c、Pac47两个，所有进行筛选的反义核酸分子长度均为20个核苷酸残基，筛选结果表明，其中七个反义核苷酸均具有不同程度的抑制人体肿瘤细胞生长的特性，将它们分别定名为Pac40、Pac41、Pac42、Pac43、Pac44、Pac45、Pac46，其中Pac42具有最高的抑制人体肿瘤细胞生长的活性。具有抑制人体肿瘤细胞生长活性的PAC系列寡聚反义核酸碱基组成及顺序如下所示PAC405’-GAA AAC GTC AGC CAT GGT CC-3’20merPAC415’-AGG ATT CAC TTC CAC TGC GG-3’20merPAC425’-CAG ACA CAA GCC GTG GCC TT-3’20merPAC435’-CCT ACA ATT TTC AGG CCT CC-3’20metPAC445’-AGA GAG ACC CTG AAC AGT TG-3’20merPAC455’-CAC TAA GAT AAT GTI CTT GG-3’20merPAC465’-GTT CTC GCT GGT GAG TTT CA-3’20mer设立阳性对照两个，是PAC14c和Pac47，其序列如下所示PAC14c5’-TCC CGC CTG TGA CAT GCA TT-3’20merPAC47 5’-GTT CTC GCT GGT GAG TTT CA-3’20mer设立阴性对照一个为PAC23，其序列如下所示PAC235’-CAC GGT GCG TCG ACG CAC TA-3’20mer以上所设计的反义核酸均是长度为20个核苷酸残基并经过硫代修饰的寡聚核苷酸，攻击目标为人体蛋白激酶C-同功酶(PKC-α)基因的信使核糖核酸(mRNA)，这段反义核酸可以在细胞质中与PKC-α基因的信使核糖核酸(mRNA)特异性结合，阻止PKC-α的产生，从而阻断了PKC-α基因编码的PKC-α激酶的表达，最终达到抑制肿瘤生长的作用。所设计的反义核酸片断是通过与PKC-α(目标基因)的mRNA的特异性杂交来发挥其特有的生物学特性。从目前来看，核酸杂本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种寡聚反义脱氧核糖（ＤＮＡ）或核糖（ＲＮＡ），其特征在于可特异性结合人体蛋白激酶Ｃ－α（ＰＫＣ－α）基因的不同区域，所述寡核苷酸序列选自：１．ＰＡＣ４０：５’－ＧＡＡ ＡＡＣ ＧＴＣ ＡＧＣ ＣＡＴ ＧＧＴ ＣＣ－３’２．ＰＡＣ４ １：５’－ＡＧＧ ＡＴＴ ＣＡＣ ＴＴＣ ＣＡＣ ＴＧＣ ＧＧ－３’３．ＰＡＣ４２：５’－ＣＡＧ ＡＣＡ ＣＡＡ ＧＣＣ ＧＴＧ ＧＣＣ ＴＴ－３’４．ＰＡＣ４３：５’－ＣＣＴ ＡＣＡ ＡＴＴ ＴＴＣ ＡＧＧ ＣＣＴ ＣＣ－３’ ５．ＰＡＣ４４：５’－ＡＧＡ ＧＡＧ ＡＣＣ ＣＴＧ ＡＡＣ ＡＧＴ ＴＧ－３’６．ＰＡＣ４５：５’－ＣＡＣ ＴＡＡ ＧＡＴ ＡＡＴ ＧＴＴ ＣＴＴ ＧＧ－３’７．ＰＡＣ４６：５’－ＧＴＴ ＣＴＣ ＧＣＴ ＧＧＴ ＧＡＧ ＴＴＴ Ｃ Ａ－３’及其同源序列。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡前进，
申请(专利权)人：北京金赛狮生物制药技术开发有限责任公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]