GHRELIN-载体偶联物制造技术

本发明专利技术涉及分子生物学、病毒学、免疫学和医学领域。本发明专利技术提供一种组成物，其包含有序、重复的抗原或抗原决定簇阵列，特别是ｇｈｒｅｌｉｎ或ｇｈｒｅｌｉｎ衍生肽的阵列。更具体而言，本发明专利技术提供一种组成物，其包含病毒样颗粒和至少一个与之结合的ｇｈｒｅｌｉｎ或ｇｈｒｅｌｉｎ衍生肽。本发明专利技术也提供制备偶联物和有序、重复阵列的方法。本发明专利技术的组成物可用于疫苗的制备，该疫苗用于治疗肥胖症和与食物摄取增加或体重增加有关的其它疾病，以及有效诱导免疫应答，特别是抗体应答。此外，本发明专利技术的组成物尤其可用于在所述范围内有效诱导自身特异性免疫应答。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
Ghrelin－载体偶联物的制作方法
技术介绍
专利
本专利技术涉及分子生物学、病毒学、免疫学和医学领域。本专利技术提供一种组成物，其包含有序、重复的抗原或抗原决定簇阵列，特别是ghrelin或ghrelin衍生肽的阵列。更具体而言，本专利技术提供一种组成物，其包含病毒样颗粒和至少一种与之结合的ghrelin或ghrelin衍生肽。本专利技术也提供分别制备偶联物和有序、重复阵列的方法。本专利技术的组成物可用于制备疫苗，该疫苗用于治疗肥胖症和与食物摄取增加或体重增加有关的其它疾病，以及有效诱导免疫应答，特别是抗体应答。此外，本专利技术的组成物尤其可用于在所述范围内有效诱导自身特异性免疫应答。相关技术肥胖是影响全世界数百万人的一种疾病。尽管肥胖的原因可能多种多样，但是几乎所有类型的肥胖的一个共同原因是食物摄取增多。有许多因子可以调节饥饿和进食行为，包括leptin(瘦素)、生长激素(GH)、神经肽Y(NPY)、刺豚鼠(agouti)相关蛋白(AGRP)等。最近鉴定的一种重要的进食行为调节因子是ghrelin(胃饥饿素)，它是胃以及脑的某些部分(下丘脑)中产生的一种酰化肽(Kojima等人．Nature 402656-660(1999))。Ghrelin由含有117个氨基酸的前蛋白原(prepro)形式酶切产生，获得在丝氨酸3处n-辛酰化的28个氨基酸长的肽。生物活性ghrelin需要在该位点n-辛酰化。已经鉴定了27个氨基酸的ghrelin第二同种型(Ghrelin-desQ14)，它在位点14处缺乏一个谷氨酰胺(Q)，然而这个同种型只是循环ghrelin的一种次要组成。同全长ghrelin一样，Ghrelin-des-Q14的生物活性依赖丝氨酸3上的n-辛酰基。然而，最强的功能活性来自于28个氨基酸的ghrelin同种型(Hosoda等人．Biochem.Biophys.Res.Commun.279(3)909-913(2000))。Ghrelin高度保守，人和大鼠ghrelin只有2个氨基酸不同(GSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO31)与GSSFLSPEHQKAQQ-RKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO32))(Kojima等人．Nature 402656-660(1999))。ghrelin受体(GHS-R)在大脑的不同区域表达，包括下丘脑中的弓状核(Arc)和腹内侧核以及脑垂体(Howard等人．Science273974-977(1996))；McKee等人．Mol Endokrin.11415-423(1997)；Guan等人，Mol brain research 4823-29(1997))，表明ghrelin主要在脑中起作用。除了刺激脑垂体释放GH之外(Kojima等人．Nature 402656-660(1999))，最近还确定ghrelin是一种重要的中枢进食调节剂(Nakazato等人，Nature 409194-198(2001))。具体而言，在脑室内施用后，ghrelin显示可刺激进食。而且，脑室内施用抗ghrelin抗体可抑制进食。Ghrelin注射诱导NPY释放的上调，抗NPY抗体以及AGRP拮抗剂阻断ghrelin诱导的进食，提示ghrelin通过增强NPY和AGRP的表达调节进食(Nakazato等人，Nature 409194-198(2001))。此外，在小鼠和大鼠中，每日外周施用ghrelin可诱导体重增加，在禁食的大鼠中血清ghrelin浓度升高，进食可以降低其浓度，这进一步提示ghrelin在调节进食方面起重要作用(Tschop等人，Nature 407908-912)。在Arc中表达反义GHS-RRNA的转基因大鼠表现为较轻的体重和较少的脂肪组织，这支持ghrelin调节体重的观点(Shuto等人，JCI 1091429-1436(2002))。也有证据表明ghrelin在人类进食行为中的重要作用。对人外周施用ghrelin可增强食欲，增加人的食物摄取(Wren等人，J ClinEndocrinol Metab 865992-5998(2001))。普拉德-威利综合征(Prader-Willi Syndrome)是人类综合性肥胖的最常见形式，其患者显示显著升高的ghrelin水平(Cummings等人．Nat Med 8643-644(2002))。另外，在节食诱导的体重减轻后，人血浆ghrelin水平也强烈升高，这与人们在停止节食后体重快速恢复有关。相反，在行胃旁路术的患者中，在节食期间及以后ghrelin水平仍然较低，在这种情况下患者通常不恢复体重((Cummings等人，N Engl J Med211623-1630(2002))。因此，在人类，ghrelin似乎是食物摄取和体重的重要调节剂。由于外周施用ghrelin能够提高食物摄取，导致体重增加(Tschop等人，Nature 407908-912)，因此胃产生的ghrelin可能通过血流到达大脑，并触发进食。因此，在动物和人类中，可能可以通过阻断ghrelin从血液向大脑迁移，从而停止食物摄取。已经证明特异性抗体能够阻断ghrelin在脑中的作用(Nakazato等人，Nature409194-198(2001))，外周抗体也可能能够阻断周围ghrelin的作用。另外，由于抗体无法穿过血脑屏障，因此ghrelin特异性抗体或许能够将ghrelin与大脑隔离，而不能作用于脑中的ghrelin。这是一个特别有吸引力的可能性，因为ghrelin也在脑中产生，可能发挥不同于调节食物摄取的功能(Nakazato等人，Nature 409194-198(2001))。因此，肥胖症的一种可能的治疗方法是在宿主中诱导ghrelin特异性抗体，使ghrelin被长期阻断，从而使食物摄取减少，这与行胃旁路术的患者中所见类似。WO98/42840公开了ghrelin和ghrelin衍生片段对胃肠道的影响，特别是对胃动力和胃排空的影响。另外，US 6′420′521也公开了短ghrelin肽影响胃功能(包括胃排空、胃收缩性和葡萄糖吸收)的用途。然而，通常难以诱导针对肽，特别是针对自身肽的抗体应答。提高接种效率的一种方法是提高所用抗原的重复程度。与分离的蛋白质不同，在不用任何佐剂、有及没有T细胞辅助的情况下，病毒均诱导快速、有效的免疫应答(Bachmann和Zinkernagel，Ann.Rev.Immunol.15235-270(1997))。尽管病毒通常几乎不含蛋白质，但是它们比其分离的成分能引发更强的免疫应答。对于B细胞应答，众所周知病毒免疫原性的一个关键因素是表面表位的重复性和秩序。许多病毒展示一种准晶体表面，其表面显示规则的表位阵列，可有效交联B细胞上表位特异性免疫球蛋白(Bachmann和Zinkernagel，Immunol.Today17553-558(1996))。B细胞上表面免疫球蛋白的这种交联是一种强激活信号，可直接诱导细胞周期的进展和IgM抗体的产生。进而，这些触发的B细胞能够激活T辅助细胞，随后诱导B细胞由产生IgM抗体向产生IgG抗体的转换，以及长期B细本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种组成物，其包含：　　　　（ａ）核心颗粒，其含有至少一个第一附着位点；和　　　　（ｂ）至少一个抗原或抗原决定簇，其含有至少一个第二附着位点，　　　　其中所述抗原或抗原决定簇是ｇｈｒｅｌｉｎ或ｇｈｒｅｌｉｎ肽，所述第二附着位点选自：　　　　（ｉ）所述抗原或抗原决定簇非天然存在的附着位点；和　　　　（ｉｉ）所述抗原或抗原决定簇天然存在的附着位点，　　　　其中所述第二附着位点能够与所述第一附着位点连接；所述ｇｈｒｅｌｉｎ或ｇｈｒｅｌｉｎ肽与所述核心颗粒通过所述连接相互作用，形成有序、重复的抗原阵列。

【技术特征摘要】
US 2002-7-19 60/396,6381.一种组成物，其包含(a)核心颗粒，其含有至少一个第一附着位点；和(b)至少一个抗原或抗原决定簇，其含有至少一个第二附着位点，其中所述抗原或抗原决定簇是ghrelin或ghrelin肽，所述第二附着位点选自(i)所述抗原或抗原决定簇非天然存在的附着位点；和(ii)所述抗原或抗原决定簇天然存在的附着位点，其中所述第二附着位点能够与所述第一附着位点连接；所述ghrelin或ghrelin肽与所述核心颗粒通过所述连接相互作用，形成有序、重复的抗原阵列。2.权利要求1的组成物，其中所述核心颗粒选自i)病毒；ii)病毒样颗粒；iii)噬菌体；iv)RNA噬菌体的病毒样颗粒；v)细菌菌毛；vi)病毒衣壳颗粒；和vii)(i)、(ii)、(iii)、(iv)、(v)或(vi)的重组形式。3.权利要求1的组成物，其中所述核心颗粒包含，优选地是病毒样颗粒，其中优选所述病毒样颗粒是重组病毒样颗粒。4.权利要求2或3任一项的组成物，其中所述病毒样颗粒包含选自下列的重组蛋白或其片段(a)重组乙型肝炎病毒蛋白；(b)重组麻疹病毒蛋白；(c)重组辛德毕斯病毒蛋白；(d)重组轮状病毒蛋白；(e)重组口蹄疫病毒蛋白；(f)重组逆转录病毒蛋白；(g)重组诺瓦克病毒蛋白；(h)重组甲病毒蛋白；(i)重组人乳头瘤病毒蛋白；(j)重组多瘤病毒蛋白；(k)重组噬菌体蛋白；(l)重组RNA噬菌体蛋白；(m)重组Ty蛋白；(n)重组Qβ-噬菌体蛋白；(o)重组GA-噬菌体蛋白；(p)重组fr-噬菌体蛋白；(q)重组AP205噬菌体蛋白；和(q)(a)-(q)中任意重组蛋白的片段。5.权利要求2或3任一项的组成物，其中所述病毒样颗粒是乙型肝炎病毒核心抗原。6.权利要求2或3任一项的组成物，其中所述病毒样颗粒包含或者由RNA噬菌体的重组蛋白或其片段组成。7.权利要求6的组成物，其中所述RNA噬菌体选自(a)噬菌体Qβ；(b)噬菌体R17；(c)噬菌体fr；(d)噬菌体GA；(e)噬菌体SP；(f)噬菌体MS2；(g)噬菌体M11；(h)噬菌体MX1；(i)噬菌体NL95；(k)噬菌体f2；(l)噬菌体PP7；和(m)噬菌体AP205。8.权利要求2-3任一项的组成物，其中所述病毒样颗粒包含或者由RNA噬菌体Qβ的重组蛋白或其片段组成。9.权利要求2-3任一项的组成物，其中所述病毒样颗粒包含或者由RNA噬菌体fr的重组蛋白或其片段组成。10.权利要求2-3任一项的组成物，其中所述病毒样颗粒包含或者由RNA噬菌体AP205的重组蛋白或其片段组成。11.权利要求3-10任一项的组成物，其中所述重组蛋白包含或者基本由或者由RNA噬菌体的外壳蛋白组成。12.权利要求11的组成物，其中所述RNA噬菌体外壳蛋白具有选自如下的氨基酸序列(a)SEQ ID NO4；(b)SEQ ID NO4和SEQ ID NO5的混合物；(c)SEQ ID NO6；(d)SEQ ID NO7；(e)SEQ ID NO8；(f)SEQ ID NO9；(g)SEQ ID NO9和SEQ ID NO10的混合物；(h)SEQ ID NO11；(i)SEQ ID NO12；(k)SEQ ID NO13；(l)SEQ ID NO14；(m)SEQ ID NO15；(n)SEQ ID NO16；和(o)SEQ ID NO28。13.权利要求3-10任一项的组成物，其中所述重组蛋白包含或者基本由或者由RNA噬菌体的突变外壳蛋白组成。14.权利要求13的组成物，其中所述RNA噬菌体选自(a)噬菌体Qβ；(b)噬菌体R17；(c)噬菌体fr；(d)噬菌体GA；(e)噬菌体SP；(f)噬菌体MS2；(g)噬菌体M11；(h)噬菌体MX1；(i)噬菌体NL95；(k)噬菌体f2；(l)噬菌体PP7；和(m)噬菌体AP205。15.权利要求13-14任一项的组成物，其中所述RNA噬菌体的突变外壳蛋白通过置换去除至少一个赖氨酸残基进行了修饰。16.权利要求13-14任一项的组成物，其中所述RNA噬菌体的突变外壳蛋白通过置换添加至少一个赖氨酸残基进行了修饰。17.权利要求13-14任一项的组成物，其中所述RNA噬菌体的突变外壳蛋白通过缺失至少一个赖氨酸残基进行了修饰。18.权利要求13-14任一项的组成物，其中所述RNA噬菌体的突变外壳蛋白通过插入添加至少一个赖氨酸残基进行了修饰。19.前述权利要求中任一项的组成物，其中所述第二附着位点能够与所述第一附着位点通过至少一个共价键连接。20.前述权利要求中任一项的组成物，其中所述第二附着位点能够与所述第一附着位点通过至少一个非肽键连接。21.前述权利要求中任一项的组成物，其中所述ghrelin或ghrelin肽与所述核心颗粒融合。22.前述权利要求中任一项的组成物，其中所述抗原或抗原决定簇是ghrelin，其选自(a)人ghrelin；(b)牛ghrelin；(c)绵羊ghrelin；(d)狗ghrelin；(e)猫ghrelin；(f)小鼠ghrelin；(g)猪ghrelin；(h)马ghrelin；和(k)(a)-(h)中任一种ghrelin的肽或其片段。23.前述权利要求中任一项的组成物，其中所述抗原或抗原决定簇是ghrelin肽，其选自(a)人ghrelin肽；(b)牛ghrelin肽；(c)绵羊ghrelin肽；(d)狗ghrelin肽；(e)猫ghrelin肽；(f)小鼠ghrelin肽；(g)猪ghrelin肽；(h)马ghrelin肽；和(k)(a)-(h)中任一种ghrelin的肽或其片段。24.前述权利要求中任一项的组成物，其中所述抗原或抗原决定簇是ghrelin肽，优选人ghrelin肽或狗ghrelin肽。25.前述权利要求中任一项的组成物，其中所述ghrelin或ghrelin肽包含或者优选地具有选自下列的氨基酸序列(a)GSSFLSPEHQRVQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO48)(b)GSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO31)(c)GSSFLSPEHQKLQQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO49)(d)GSSFLSPEHQKLQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO50)(e)GSSFLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO32)(f)GSSFLSPEHQKAQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO51)(g)KKPPAKLQPR(SEQ ID NO52)(h)PPAKLQPR(SEQ ID NO53)(i)AKLQPR(SEQ ID NO54)(j)GSSFLSPEHQ(SEQ ID NO55)(k)EHQRVQQRKE(SEQ ID NO56)(l)KLQPR(SEQ ID NO59)(m)GSSFLSPEHQRVQ(SEQ ID NO60)(n)QRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO61)(o)GSSFLSPEHQKLQ(SEQ ID NO62)(p)QRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO63)(q)EHQRVQQRKES(SEQ ID NO111)(r)EHQKAQQRKE(SEQ ID NO112)(s)EHQKAQQRKES(SEQ ID NO113)(t)EHQKLQQRKE(SEQ ID NO114)(u)EHQKLQQRKES(SEQ ID NO115)(v)LSPEHQRVQQ(SEQ ID NO116)(w)LSPEHQKAQQ(SEQ ID NO117)(x)LSPEHQKLQQ(SEQ ID NO118)，和(y)GSSFLSP(SEQ ID NO119).26.前述权利要求中任一项的组成物，其中所述抗原或抗原决定族是具有至少一个ghrelin抗原性位点的ghrelin肽。27.前述权利要求中任一项的组成物，进一步含有氨基酸接头，其中所述氨基酸接头包含或者由所述第二附着位点组成。28.前述权利要求中任一项的组成物，其中所述第二附着位点或含有所述第二附着位点的氨基酸接头在C端或N端与所述ghrelin或ghrelin肽结合。29.前述权利要求中任一项的组成物，其中所述第二附着位点或含有所述第二附着位点的氨基酸接头选自(a)GGC；(b)GGC-CONH2；(c)GC；(d)GC-CONH2；(e)C；和(f)C-CONH2。30.前述权利要求中任一项的组成物，其中至少含有所述第二附着位点的所述ghrelin或ghrelin肽包含、优选地由选自下列的氨基酸序列组成(a)CGSSFLSPEHQRVQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO64)(b)CGSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO65)(c)CGSSFLSPEHQKLQQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO71)(d)CGSSFLSPEHQKLQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO72)(e)CGSSFLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO77)(f)CGSSFLSPEHQKAQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO106)(g)GSSFLSPEHQRVQRKESKKPPAKLQPRC(SEQ ID NO66)(h)GSSFLSPEHQRVQRKESKKPPAKLQPRGC(SEQ ID NO120)(i)GSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPRC(SEQ ID NO67)(j)GSSFLSPEHQRVQQRKESKKPPAKLQPRGC(SEQ ID NO121)(k)GSSFLSPEHQKLQQRKESKKPPAKLQPRC(SEQ ID NO73)(l)GSSFLSPEHQKLQQRKESKKPPAKLQPRGC(SEQ ID NO123)(m)GSSFLSPEHQKLQRKESKKPPAKLQPRC(SEQ ID NO74)(n)GSSFLSPEHQKLQRKESKKPPAKLQPRGC(SEQ ID NO124)(o)GSSFLSPEHQKAQQRKESKKPPAKLQPRC(SEQ ID NO105)(p)GSSFLSPEHQKAQRKESKKPPAKLQPRC(SEQ ID NO107)(q)CKKPPAKLQPR(SEQ ID NO108)(r)CPPAKLQPR(SEQ ID NO70)(s)CAKLQPR(SEQ ID NO109)(t)GSSFLSPEHQC(SEQ ID NO110)(u)CEHQRVQQRKE(SEQ ID NO76)(v)GSSFLSPEHQRVQC(SEQ ID NO68)(w)GSSFLSPEHQRVQGC(SEQ ID NO122)(x)CQRKESKKPPAKLQPR(SEQ ID NO69)(y)GSSFLSPEHQKLQC(SEQ ID NO75)(z)GSSFLSPEHQKLQGC(SEQ ID NO125)(aa)GSSFLSPEHQKAQRKESKKPPAKLQPRC(SEQ ID NO126)(bb)GSSFLSPEHQK...

【专利技术属性】
技术研发人员：马丁F巴克曼，阿尔玛富卢里贾，
申请(专利权)人：赛托斯生物技术公司，
类型：发明
国别省市：CH[瑞士]