重组病毒、保持该重组病毒的大肠杆菌及其制备方法技术

本发明专利技术在于提供一种保持目标病毒基因组的性状的重组病毒的制备方法。该重组病毒的制备方法特征在于：在目标病毒基因组中互相呈逆向编码的２种基因的ｐｏｌｙＡ信号间的区域插入外源基因。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及对疫苗开发或基因治疗载体开发等有用的重组病毒制备方法、保持单 纯疱疹病毒II型的基因组全长的重组病毒和保持该重组病毒的大肠杆菌。
技术介绍
为了制备称为基因治疗载体或多价疫苗的重组病毒，必须在病毒基因组的任一区 域插入外源基因。但是，得到的重组病毒存在缺失原来的基因治疗载体或疫苗的病毒基因 组的基因，或使其性状变化的问题。作为重组病毒的制备技术的现有的方法，已知有利用标记(TK，LacZ)基因的培养 细胞内的同源重组法(非专利文献1)和利用黏端质粒的培养细胞内的同源重组法(非专 利文献2、等，但这些现有的方法均是涉及要插入的外源基因一方的技术，而没有着眼于被 插入一方病毒基因组。而单纯疱疹病毒(HSV :herpes simplex virus)感染症是由HSV-1或HSV-2的感 染引起的。HSV-I主要感染以口腔、上呼吸道粘膜为中心的上半身，诱发口腔炎或唇疱疹。 另一方面，HSV-2主要感染以生殖器为中心的下半身，诱发生殖器疱疹。HSV的疫苗仍没有 被开发。此外，HSV作为基因治疗载体也有用，有几例进入临床试验阶段。为了开发病毒的疫苗或基因治疗载体，需要重组病毒制备的技术。疫苗的开发中， 必须灭活致病因素，而基因治疗载体的开发中，除了需要灭活致病因素之外，还需要载入外 源基因。近年，报告了利用作为大型DNA克隆系统(DNA cloning system)的杆状病毒系统 (bac system,bacterial artificial chromosome system)进行大肠杆菌内的同源重组的 方法，与过去相比，重组病毒的制备变得迅速并且简便。杆状病毒系统中作为核心的材料是保持病毒基因组的大肠杆菌。如果能够获得这 样的大肠杆菌，利用大肠杆菌的遗传学，则各种病毒基因组的改变成为可能。此外，在杆状 病毒系统中，在病毒基因组中插入杆状病毒质粒对大肠杆菌保持基因组是必须的，杆状病 毒质粒的插入存在引起病毒基因组的基因缺失、使野生型的病毒性状变化的问题。但是，在 涉及HSV的利用杆状病毒的保持病毒基因组的大肠杆菌的制备的现有的报告例中，由杆状 病毒质粒(bacmid)的插入引起包装信号(Packaging signal)的缺失(非专利文献3 5)，或者在TK (非必须HSV基因)中插入杆状病毒质粒(非专利文献6)的情况较多。如果 存在这样的缺失或插入，则有时出现不适用于制作多功能载体的情况，而且，也成为病毒自 身在基础研究上应用的障碍。此外，由于杆状病毒质粒为71Λρ，比较大，导致重组病毒的病 原性或限定保持其重组病毒的外源基因的长度，因此需要切除的系统。关于HSV-1，之前报告了通过在UL3以及UL4基因的基因间区域中插入杆状病毒质 粒，成功制备保持具有野生型的性状的全长的感染性HSV-I病毒基因组的大肠杆菌(专利 文献1)。然而，关于HSV-2，没有得到含有实质上保持基因组全长的重组病毒的大肠杆菌。专利文献1 日本特开2003-189882号公报非专利文献1 =Post L. Ε. et al. Cell24 :555-565,1981非专利文献2 =CunninghamC. et al. Virol. 197 :116-124，1993非专利文献3 Saeki Y. et al. Hum. Gen. Ther. 9 :2787-2794,1998非专利文献4 :Tom Α. S. et al. J. Virol. 72 :7137-7143,1998非专利文献5 Suter Μ. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 :12697-12702，1999非专利文献6 =Horsburgh B. C. et al. GeneTher. 6 :922-930,1999
技术实现思路
本专利技术的课题在于提供一种不缺失病毒基因组的基因或使其性状变化地在病毒 基因组中插入外源基因的方法。另外，本专利技术在于提供保持有HSV-2的基因组的全长的重组HSV-2，并提供保持有 该病毒基因组的大肠杆菌。这里，为了对不使目的病毒基因组含有的基因缺失且不对性状产生影响地插入外 源基因而制备重组病毒，本专利技术的专利技术人进行了各种研究，发现作为外源基因的插入区域， 如果选择目的病毒基因组中互相呈逆向编码的基因PolyA信号间的区域，则能够容易地制 备目的重组病毒。并且，发现在HSV-2中，如果在UL50和UL51的基因的polyA信号间区域 插入杆状病毒质粒，则可以得到实质上保持HSV-2基因组全长的重组HSV-2，通过在大肠杆 菌中保持该病毒基因组，从而完成了本专利技术。S卩，本专利技术在于提供一种重组病毒的制备方法，特征在于在目标病毒基因组中互 相逆向编码的2种基因的polyA信号间的区域(除了 HSV-I的UL3-UL4之间)插入外源基 因。此外，本专利技术在于提供一种实质上保持野生型病毒基因组的全长的重组病毒基因 组导入大肠杆菌的制备方法，特征在于将在目标病毒基因组中互相呈逆向编码的2种基 因的PolyA信号间的区域中(除了 HSV-I的UL3-UL4)插入杆状病毒质粒而得到的重组病 毒基因组导入大肠杆菌中。此外，本专利技术在于提供一种重组HSV-2，其实质上保持野生型HSV-2的基因组全 长，在其基因组的UL50-UL51基因间区域中插入杆状病毒质粒。另外，本专利技术在于提供一种保持有重组HSV-2基因组的大肠杆菌，该重组单纯疱 疹病毒II型实质上保持野生型HSV-2的基因组的全长，在其基因组的UL50-UL51基因间区 域中插入有杆状病毒质粒。专利技术的效果根据本专利技术，能够容易地制备作为疫苗开发或基因治疗载体开发的工具有用的重 组病毒。此外，作为外源基因，如果使用杆状病毒质粒，可以得到保持该重组病毒基因组的 大肠杆菌。由于得到的大肠杆菌显著使病毒改变变得简便，因此利用其而使疫苗开发或基 因治疗载体开发变为可能。此外，由于本专利技术的重组HSV-2实质上保持野生型HSV-2的基因组全长，因此对用 于基因表达或疫苗开发的载体以及基础研究有用。附图说明图1是表示作为插入部位的polyA信号间区域的图。图2是表示YK336、YK338、YK339的构建工序的图。图3是表示1381和1382的构建工序的图。图4是表示HSV-I、ΥΚ336、ΥΚ338和ΥΚ339的增殖能力的图。 图5是表示HSV-2、ΥΚ381和1382的增殖能力的图。图6是表示pBS-2NC-GFP/BAC的构建工序的图。图7是表示ΥΚ351和YEbac356的构建工序的图。图8是表示1356(在图中用BAC表示)的限制性内切酶的酶切图谱的图。图中， HSV-2(186)为野生型。图9是表示1356(在图中用BAC表示)和野生型HSV-2186 (在图中用186表示) 的增殖能力的图。图中[]内表示MOI (感染复数)。上段表示细胞内病毒量，下段表示细胞 夕卜病毒量。图10表示对小鼠的感染实验结果(生存曲线)。BAC为1356，186为野生型。图11是表示1361的构建工序的图。图12是表示YK801和YIC356的Southern印迹的结果的图。图13表示野生型(wt)和Us3突变导入(US3-KM)的点突变的结果。具体实施例方式本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种重组病毒的制备方法，其特征在于：　　在目标病毒基因组中互相呈逆向编码的２种基因的ｐｏｌｙＡ信号间的区域（除了ＨＳＶ－１的ＵＬ３－ＵＬ４之间）插入外源基因。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】JP 2008-5-30 2008-1426621.一种重组病毒的制备方法，其特征在于在目标病毒基因组中互相呈逆向编码的2种基因的POlyA信号间的区域(除了 HSV-I 的UL3-UL4之间)插入外源基因。2.如权利要求1所述的重组病毒的制备方法，其特征在于外源基因选自杆状病毒质粒、报告基因、编码具有免疫原性的蛋白质的基因和用于基 因治疗的基因。3.一种实质上保持野生型病毒基因组的全长的重组病毒基因组导入大肠杆菌的制备 方法，其特征在于将在目标病毒基因组中互相呈逆向编码的2种基因的polyA信号间的...

【专利技术属性】
技术研发人员：川口宁，森本智美，
申请(专利权)人：国立大学法人东京大学，
类型：发明
国别省市：JP[日本]