免疫原性减弱的经修饰鱼精蛋白制造技术

本发明专利技术涉及尤其是用于对人施用的、特别是用于治疗的多肽。所述的多肽是经修饰的多肽，其中，所述的修饰使得上述多肽在施用于人体时引起免疫应答的倾向减弱。本发明专利技术特别涉及对鱼精蛋白进行修饰以产生在体内使用时基本上无免疫原性，或比未经修饰的相应蛋白免疫原性低的鱼精蛋白。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及尤其是用于对人施用的、特别是用于治疗的多肽。所述的多肽是经修饰的多肽，其中，所述的修饰使得上述多肽在施用于人体时引起免疫应答的倾向减弱。本专利技术特别涉及对鲑鱼鱼精蛋白进行修饰以产生鱼精蛋白变体，该变体在体内使用时基本上无免疫原性，或比未经修饰的相应蛋白的免疫原性低。本专利技术还涉及来自上述未经修饰蛋白的T-细胞表位肽，由此可以构建免疫原性减弱的鱼精蛋白变体。
技术介绍
有许多例子表明治疗蛋白的效率受限于针对所述治疗蛋白的干扰性免疫反应。已有若干种小鼠单克隆抗体表现出治疗多种人类疾病的前景，但在某些情况下由于诱导出相当程度的人抗小鼠抗体(HAMA)应答而未能成功应用[Schroff，R.W.等(1985)Cancer Res.45879-885；Shawler，D.L.等(1985)J.Immunol.1351530-1535]。对于单克隆抗体，已发展了多种技术以试图减弱HAMA应答[WO89/09622；EP0239400；EP0438310；WO91/06667]。这些重组DNA方法通常是减少最终的抗体构建体中小鼠的遗传信息，同时增加最终构建体中人的遗传信息。尽管如此，在许多情况下，所得的“人源化”抗体仍然引起患者的免疫应答[Issacs J.D.(1990)Sem.Immunol.2449，456；Rebello，P.R.等(1999)Transplantation 681417-1420]。抗体不是唯一一类作为治疗剂施用的可引起免疫应答的多肽分子。即使是人源的并在人与人之间具有相同氨基酸序列的蛋白质仍可在人体中诱导免疫应答。明显的实例包括粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的治疗性应用(Wadhwa，M.等人(1999)临床癌研究(Clin.Cancer Res.)51353-1361)和干扰素α2的治疗性应用(Russo，D.等人(1996)Bri.J.Haem.94300-305；Stein，R.等人(1988)新英格兰医学杂志(New Engl.J.Med.)3181409-1413)等。诱导免疫应答的主要因素是在蛋白中存在可经由MHC II类分子的呈递作用激活T-细胞活性的肽(即所谓的T-细胞表位)。这种潜在的T-细胞表位通常定义为任何能够与MHC II类分子结合的氨基酸残基序列。可测定此种T-细胞表位以建立MHC结合。隐含地，″T-细胞表位″是指当其与MHC分子结合时可被T-细胞受体(TCR)识别的表位，并且至少原则上，这种表位可以通过与TCR相互作用而激活这些T-细胞以促进T-细胞应答。但是，通常都知道，可以将某些被发现可以结合MHCII类分子的肽保留在蛋白质序列中，因为此类肽在最终蛋白质所施用至的生物体内被识别为“自己”。已知这些T-细胞表位肽中的某些可在肽、多肽或蛋白的细胞内降解过程中释放出来，随后由主要组织相容性复合体(MHC)分子呈递以引发T-细胞激活作用。对于MHC II类分子呈递的肽，然后这种T-细胞激活作用可，例如通过直接刺激B细胞产生抗体而引起抗体应答。MHC II类分子为一组在T辅助细胞的选择和活化中起中心作用的高度多态性蛋白质。人类白细胞抗原群DR(HLA-DR)为该组蛋白质的主要同种型，也是本专利技术的主要集中点。但是，同种型HLA-DQ和HLA-DP行使相类似的作用，因此本专利技术同样适用于它们。MHC II类DR分子由α和β链组成，它们的C-末端插入并穿过细胞膜。虽然结合沟可容纳最多11个氨基酸，但每一异源-二聚体具有一个能结合长度在9至20个氨基酸之间的肽的配体结合结构域。配体结合结构域由α链的1至85位氨基酸和β链的1至94位氨基酸组成。最近证实DQ分子具有同源结构，预期DP家族的蛋白质亦非常相似。人类已知存在DR同种型的约70种不同的同种异型，对于DQ已知存在30种不同的同种异型且对于DP已知存在47种不同的同种异型。每一个体具有二至四个DR等位基因，两个DQ和两个DP等位基因。已解析了许多DR分子的结构，这些结构揭示了一个具有一些可结合肽的疏水残基(口袋残基)的疏水口袋的敞口肽结合沟[Brown等人，自然(Nature)(1993)36433；Stern等人(1994)自然(Nature)368215]。确定II类分子的不同同种异型的多态性促成了肽结合沟内用于结合肽的不同表面的大量多样性，并在群体水平上确保了在识别外源蛋白质并引起对病原生物体的免疫应答的能力方面有最大的灵活性。在配体结合结构域内有相当多的多态性，其中在不同地理人群和种族群体中具有不同的″家族″。该多态性影响肽结合结构域的结合特性，因此DR分子的不同″家族″将对具有不同序列特性的肽存在特异性，虽然可能存在一些重叠。该特异性决定了Th-细胞表位的识别(II类T细胞应答)，其最终负责驱动对B细胞表位的抗体应答，其中所述B细胞表位存在于Th-细胞表位所来自的同一蛋白质上。这样，个体对蛋白质的免疫应答很大程度上受T细胞表位识别的影响，其随个体的HLA-DR同种异型的肽结合特异性而改变。因此，为了在世界人群中鉴定蛋白质或肽中的T细胞表位，就可能希望考虑到尽可能多样的HLA-DR同种异型集合的结合特性，由此覆盖尽可能高的世界人口百分率。针对治疗性蛋白(如本专利技术的目的蛋白)的免疫应答通过MHC II类肽呈递途径进行。其间外来蛋白经吞噬和加工后与DR、DQ或DP型MHC II类分子结合以进行呈递。MHC II类分子由专门抗原呈递细胞(APC)如巨噬细胞、树突状细胞等表达。通过MHC II类肽复合体与T细胞表面的关联性T-细胞受体的相互作用，及与某些其他共同受体，如CD4分子的交联结合可诱导T-细胞进入激活状态。上述激活作用可导致细胞因子释放，进一步激活其他淋巴细胞如B细胞产生抗体或激活T杀伤细胞形成完整的细胞免疫应答。肽与给定的MHC II类分子结合以备在APC表面呈递的能力依赖于多种因素，最主要的是肽的一级结构。这影响其蛋白酶剪切倾向及其在MHC II类分子的肽结合隙中的结合亲和性。在APC表面的MHC II类/肽复合体向特定T-细胞受体(TCR)呈递一个结合面，其中所述T细胞受体能识别由肽和MHC II类分子的暴露残基共同提供的决定簇。本领域中有鉴定能结合MHC II类分子的合成肽的方法(例如WO98/52976和WO00/34317)。这种肽不是在所有情况下都行使T细胞表位的功能，特别是在体内会受加工途径和其他现象的影响。T-细胞表位鉴定是表位清除的第一步。鉴定及从蛋白中去除潜在T-细胞表位先前已有公开。本领域中已有检测T-细胞表位的方法，通常是通过计算机手段在经试验确定的T-细胞表位中扫描公认的序列基元，或利用计算机技术预测MHC II类结合肽，特别是DR-结合肽。WO98/52976和WO00/34317中公开了鉴定具有与人MHC II类DR同种异型亚群结合的潜在能力的多肽序列的计算机穿线方法(computational threadingapproaches)。这些教导中，通过在人源或非人源治疗性抗体或非抗体蛋白一级序列中进行明智的氨基酸替代以去除预测的T-细胞表位。本领域中还使用了其它技术，这些技术利用重组MHC分子与合成肽组合形成的可与来自人或实验动物受试者外周血样本的T细胞克隆结合的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种经修饰的分子，其具有鲑鱼鱼精蛋白的生物学活性，且当其在体内应用时基本上无免疫原性或免疫原性低于任何具有相同生物学活性但未经修饰的分子。

【技术特征摘要】
EP 2001-3-8 01105778.31.一种经修饰的分子，其具有鲑鱼鱼精蛋白的生物学活性，且当其在体内应用时基本上无免疫原性或免疫原性低于任何具有相同生物学活性但未经修饰的分子。2.如权利要求1所述的分子，其中，所述的免疫原性丧失是通过从原始的未经修饰的分子中去除一个或多个T-细胞表位而实现的。3.如权利要求1或2所述的分子，其中，所述的免疫原性丧失是通过减少能与源自所述分子的肽相结合的MHC同种异型的数量来实现的。4.如权利要求2或3所述的分子，其中，去除了一个T-细胞表位。5.如权利要求2-4中任意一项所述的分子，其中，原本存在的T-细胞表位是MHC II类配体或表现出经II类分子呈递后有刺激或结合T-细胞的能力的肽序列。6.如权利要求5所述的分子，其中，所述的肽序列选自如表1所示的序列。7.如权利要求2-6中任意一项所述的分子，其中，任何原本存在的T-细胞表位中的1-9个氨基酸残基发生了改变。8.如权利要求7所述的分子，其中，有一个氨基酸残基发生了改变。9.如权利要求7或8所述的分子，其中，所述氨基酸残基的改变是用其他的氨基酸残基在特定的位置替代原本存在的氨基酸残基。10.如权利要求9所述的分子，其中，按表2所示进行一个或多个氨基酸残基的替代。11.如权利要求10所述的分子，其中，另外还按表3所示进行一个或多个氨基酸残基的替代以减少能与源自所述分子的肽相结合的MHC同种异型的数量。12.如权利要求9所述的分子，其中，按表3所示进行一个或多个氨基酸的替代。13.如权利要求7或8所述的分子，其中，所述氨基酸残基的改变是在特定的位置缺失原本存在的氨基酸残基。14.如权利要求7或8所述的分子，其中，所述氨基酸残基的改变是在特定的位置向原始序列中添加氨基酸残基。15.如权利要求7-14中任意一项所述的分子，其中，通过进一步的改变恢复所述分子的生物学活性。16.如权利要求15所述的分子，其中，进一步的改变是替代、添加或缺失特定的氨基酸。17.如权利要求7-16中任意一项所述的修饰分子，其中，所述氨基酸的改变是参照同源蛋白序列进行的。18.如权利要求7-16中任意一项所述的修饰分子，其中，所述氨基酸的改变是参照in silico建模技术进行的。19.如权利要求1-17中任意一项所述的修饰分子，其中，在自N-末端计算的第12和/或20和/或28位进行了修饰。20.编码权利要求1-19中任意一项所述的经修饰鱼精蛋白的DNA序列。21.一种药物组合物，其包含上述任意一项权利要求中所定义的具有鱼精蛋白生物学活性的经修饰分子，并可任选地包含药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。22.制备上述任意一项权利要求中所定义的具有鱼精蛋白生物学活性的经修饰分子的方法，该方法包括下述步骤(i)确定所述多肽或其中一部分的氨基酸序列；(ii)通过任意方法，包括利用体外或in silico技术或生物学试验确定所述肽与MHC分子的结合，由此鉴定所述蛋白的氨基酸序列中潜在的一个或多个T-细胞表位；(iii...

【专利技术属性】
技术研发人员：FJ卡尔，G卡特，
申请(专利权)人：默克专利有限公司，
类型：发明
国别省市：DE[德国]