本发明专利技术属于生物医药技术领域，具体涉及一种具有肝素传递功能的鱼精蛋白-脱氧胆酸偶联物的制备方法。其以鱼精蛋白的氨基与脱氧胆酸的羧基通过交联剂作用形成酰胺键，制备得到双亲性的偶联物，再与肝素形成自组装聚集体，以利于肝素在细胞内的释放。偶联物的疏水性修饰可增强纳米复合物自聚集稳定性；偶联物的阳离子性能包载肝素，增加肝素在细胞内的分布能力，避免肝素受肝素酶作用降解，从而实现肝素向肿瘤细胞内的传递及其在细胞内的释放和生物学效应。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及。
技术介绍
肝素作为一种高度硫酸化的多糖，长期以来一直作为抗凝血药物被广泛应用且效果良好。近年来，有研究证实肝素可延长恶性肿瘤患者的存活时间。由于肝素具有良好的生物相容性、水溶性和生物可降解等诸多优点，目前对于肝素在抗肿瘤方面应用的研究较多。已有研究表明肝素的抗肿瘤作用可分为细胞外作用和细胞内作用，在细胞外，肝素可抑制血管内皮生长因子和成纤维生长因子刺激的血管内皮细胞的增殖，抑制肿瘤新生血管的形成；肝素进入细胞后，可与细胞内转录因子结合，使转录因子无法正常发挥作用，从而干扰肿瘤细胞的生长增殖。研究发现肝素的抗肿瘤作用涉及抑制肿瘤形成、癌细胞生长及转移各个环节，在这些环节中肝素与其他物质相互作用，扮演着重要的角色。不过肝素在细胞内才能表现出良好的肿瘤细胞的抑制效果，因而目前的研究主要集中于肝素的细胞内传递释放。虽然肝素的抗肿瘤作用展现了良好的应用前景，但是肝素在溶液中，其分子表面带大量负电荷，难以通过负电性的细胞膜进入细胞，并且易与血浆中蛋白结合，易被细胞表面的肝素酶降解。脱氧胆酸是胆汁酸的主要成分，它并非是肝细胞最初产生的胆汁酸，而是经历了肠道细菌的分解，以及肠肝循环后形成的产物。脱氧胆酸在体内胆固醇、脂肪酸及脂溶性维生素的乳化、溶解及吸收方面起了重要的作用。脱氧胆酸具有高效率的肝肠吸收，高容量的胆酸传输，所以它的载药和释药能力引人注目，使其在作为药物载体的偶联物的材料时具有许多优势。鱼精蛋白是一种天然的碱性蛋白，分子量通常在IOk以下，等电点10-12，由30个左右的氨基酸构成，其中2 / 3以上为精氨酸。鱼精蛋白独特的结构以及在生理pH下带正电荷，使其能够在基因输送系统中获得应用。研究表明，鱼精蛋白携带大量正电荷，能够有效压缩负电性的DNA，使得复合体粒径变小，提高转染效率；鱼精蛋白携带NLS序列，具有靶向定位于细胞核的功能，能够在体外与DNA复合后保护DNA不被脱氧核糖核酸酶DNaseI降解，便于携带外源DNA进入细胞核。因此鱼精蛋白具有成为非病毒基因载体的潜力，但将其独立作为基因载体却少有报道，这与鱼精蛋白单独使用时转染效率较低有关，而造成鱼精蛋白转染效率低的可能原因主要有两方面:其一，鱼精蛋白的亲水性很强，不具备两亲性，这使它很难穿过细胞膜，因为细胞膜的主要组成是具有两亲性的磷脂双层。其二，鱼精蛋白与DNA形成的复合物结构过于紧密，这使得DNA很难从鱼精蛋白/ DNA的复合物中释放出来。通过对鱼精蛋白进行疏水修饰，可有效提高其转染效果。基于上述分析，本专利技术采用脱氧胆酸修饰的鱼精蛋白，形成双亲性的偶联物，与肝素形成的自组装聚集体，利于肝素在细胞内的释放。疏水性修饰可增强纳米复合物自聚集稳定性，在水中的聚集体是通过疏水相互作用自组装而形成的；偶联物的阳离子性能包载肝素，增加肝素在细胞内的分布能力，避免肝素受肝素酶作用降解，从而实现肝素在细胞内的释放和生物学效应。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供。本专利技术的技术方案为:以鱼精蛋白的氨基与脱氧胆酸的羧基通过交联剂作用形成酰胺键，形成自聚集纳米粒子，通过静电作用与肝素形成复合物，通过内吞作用携带肝素进入细胞，在细胞内发挥更好地生物学效应。本专利技术提出的具有肝素传递功能的鱼精蛋白-脱氧胆酸偶联物的制备方法的具体操作步骤如下:鱼精蛋白的氨基与脱氧胆酸的羧基通过交联剂作用形成酰胺键，合成一系列偶联程度不同的鱼精蛋白-脱氧胆酸偶联物，合成产物进行紫外光谱和红外光谱扫描以确定结构。将所制备的载体材料和肝素按不同质量比通过静电作用形成复合物，测定纳米复合物的粒径及其分布情况以及纳米粒子的Zeta-电位。将其中较为理想的纳米复合物粒子作用于肿瘤细胞，在荧光倒置显微镜下观察肝素在鱼精蛋白-脱氧胆酸偶联物作用下向肿瘤细胞内传递的情况，并分析其对肿瘤细胞生长的影响。本专利技术的独到之处有两点:首先采用脱氧胆酸对鱼精蛋白进行疏水性修饰，制备得到一种两亲性的载体，以提高载体的转载效率。其次将制备得到的载体运用于肝素向细胞内的传递，使肝素借助该载体实现更大限度的细胞内的分布，从而达到细胞内直接作用于转录因子，抑制肿瘤细胞生长增殖的作用。【具体实施方式】以下利用实施例进`一步详细说明本专利技术，但不能认为是限定专利技术的范围。[0011 ] 实施例一:D0CA-NHS的制备将3.54g 脱氧胆酸(DOCA)、2.40gN, N，- 二环己基碳二亚胺(DCC)和 1.48gN_ 羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合，加入30ml四氢呋喃制成悬浊液，DOCA、NHS、DCC的摩尔比为:1:1.2:1.2，NHS和DCC浓度要略高于DOCA从而使得活化完全。混合液室温下在氮气环境中磁力搅拌反应12小时，过滤去掉产生的白色二环己基脲沉淀。向滤液中加入过量的正丁烷，未反应的DCC，NHS溶于正丁烷中，白色沉淀即为琥珀酰化D0CA，抽滤得到沉淀，用正丁烷充分洗涤，室温真空干燥得到脱氧胆酸活泼酯(DOCA-NHS)。红外吸收光谱图分析得知，产物DOCA-NHS在2933CHT1和2862CHT1处出现了较强的吸收峰，此处由活泼酯中的饱和碳氢键产生。1813,1783以及1740CHT1的吸收峰由结构中的C=O产生，这一组吸收峰出现明显裂分是由于活泼酯的NHS部分中环状结构有靠近的两个C=O造成的；除此以外，1207cm-1和1067CHT1处由酯键产生的吸收峰也进一步证实活泼酯的成功合成。实施例二:鱼精蛋白-脱氧胆酸偶联物的制备将硫酸鱼精蛋白(SP)溶解在含有8M脲的pH9.0的硼酸缓冲溶液中，室温下磁力搅拌溶解完全后加入含有NHS和DOCA-NHS的THF溶液，最后形成含30% (v / v)THF的水/四氢呋喃混合反应体系。在25°C下反应1.5小时，用透析袋(截流分子量3500)在4°C下透析过夜，透析液为含有150mM NaCl的pH7.4磷酸缓冲液。随后，粗产物用1.0M的HCl调节PH到5.0，然后用乙醚洗涤5次，除去未反应活泼酯分解产生的水不溶性脱氧胆酸，再用超纯水作为透析液透析72小时后冻干得鱼精蛋白-脱氧胆酸偶联物。通过1H-NMR检测可知,0.67ppm、0.90ppm、0.97ppm分别对应于脱氧胆酸结构中18、19和21位甲基的化学位移，是脱氧胆酸非常特征的核磁共振峰，表明DOCA-NHS已与SP连接，形成DP偶联物。实施例三:鱼精蛋白-脱氧胆酸偶联物/肝素纳米复合物的制备取一定量的肝素钠溶液，缓慢滴加到一定量的鱼精蛋白-脱氧胆酸偶联物溶液中，边滴加边震荡，滴加完毕后立即震荡5~10分钟，静置30分钟，使用透射电子显微镜观察颗粒的表观形态。按照以上方法分别制备鱼精蛋白-脱氧胆酸偶联物与肝素的重量比(w / w)分别为0.1~20的复合物，并控制肝素钠的终浓度为0.04mg / ml，测定和肝素以不同质量比结合所得的纳米复合物的粒径及其分布情况以及纳米粒子的Zeta-电位。鱼精蛋白-脱氧胆酸偶联物/肝素比例为1.5:1时的粒径较为稳定，粒径在135nm左右，电位在+30mV左右，为最佳配比，此后可被用作细胞实验配比。实施例四:鱼精蛋白-脱氧胆酸偶联物/肝素纳米复合物在细胞内的分布与体外抗肿瘤作用使用FITC标记肝素，进行纳米复合物的细胞本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种具有肝素传递功能的鱼精蛋白?脱氧胆酸偶联物的制备方法，是以鱼精蛋白的氨基与脱氧胆酸的羧基通过交联剂作用形成酰胺键，形成自聚集纳米粒子，通过静电作用与肝素形成复合物，通过内吞作用携带肝素进入细胞，在细胞内发挥更好地生物学效应。
【技术特征摘要】
1.一种具有肝素传递功能的鱼精蛋白-脱氧胆酸偶联物的制备方法，是以鱼精蛋白的氨基与脱氧胆酸的羧基通过交联剂作用形成酰胺键，形成自聚集纳米粒子，通过静电作用与肝素形成复合物，通过内吞作用携带肝素进入细胞，在细胞内发挥更好地生物学效应。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:将3.54g脱氧胆酸(DOCA)、2.40gN，N’_ 二环己基碳二亚胺(DCC)和1.48g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)混合，加入30ml四氢呋喃制成悬浊液，DOCA、NHS、DCC的摩尔比为:1:1.2:1.2, NHS和DCC浓度要略高于DOCA从而使得活化完全；混合液室温下在氮气环境中磁力搅拌反应12小时，过滤去掉产生的白色二环己基脲沉淀；向滤液中加入过量的正丁烷，未反应的DCC，NHS溶于正丁烷中，白色沉淀即为琥珀酰化D0CA，抽滤得到沉淀，用正丁烷充分洗涤，室温真空干燥得到脱氧胆酸活泼酯(DOCA-NHS)。3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于:将硫酸鱼精蛋白(SP)溶解在含有SM脲的pH9.0的硼酸缓冲溶液中，室温下磁力搅拌溶解完全后加入含有NHS和DOCA-NHS的THF溶液，最后形成含30% (v...
【专利技术属性】
技术研发人员：滕丽萍，张艺壤，付海田，王敏，陈敬华，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：
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