肝素结合蛋白的重组生产制造技术

一种用于回收并纯化在异源宿主细胞中生产的、重折叠的肝素结合蛋白的方法包括将该溶解的蛋白质与聚阴离子诸如硫酸右旋糖苷一起温育的步骤。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】肝素结合蛋白的重组生产 相关申请本申请要求下述申请的优先权及利益2005年12月22日提交的美国临时 申请流水号60/753,615和2006年7月14日提交的美国临时申请流水号 60/807,432，在此完整收录其说明书。专利
本专利技术涉及用于获得在细胞培养物中生产的肝素结合蛋白的方法。本发 明包括用于回收和纯化重折叠的肝素结合蛋白的方法，该蛋白质在原核宿主 细胞中生产并且存在于这些细胞中，典型地存在于周质空间或胞内空间。该 在原核宿主细胞中生产的肝素结合蛋白还可以被发现作为可溶性蛋白质或 者可溶性和不溶性蛋白质的混合物。专利技术背景已知一大批天然存在的、有生物学活性的多肽能结合肝素。这样的肝素 结合多肽包括细胞因子，诸如血小板因子4和IL-8 (Barber et al.， (1972) Biochim. Biophvs. Acta, 286:312-329; Handin et al.， (1976) J. Biol. Chem.' 251:4273-422; Loscalzo et al., (1985) Arch. Biochem. Biophys., 240:446-455; Zucker et al.， (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 86:7571-7574; Talpas et al., (1991) Biochim. Biophys. Acta, 1078:208-218; Webb et al" (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:7158-7162);肝素结合生长因子(Burgess and Maciag, (1989) Annu. Rev. Biochem., 58:576-606; Klagsbrun, (1989) Prog. Growth Factor Res., 1:207-235),诸如表皮生长因子(EGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、碱性成 纤维细胞生长因子(bFGF)、酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)、血管内皮生长 因子(VEGF)、和肝细胞生长因子(HGF)(Liu et al.， (1992) Gastrointest. Liver Physiol., 26:G642-G649);及选择蛋白，诸如L-选择蛋白、E-选择蛋白和P-选 择蛋白(Norgard-Sumnicht et al.， (1993) Science, 261:480-483)。还可参见 Mu腿and Linhardt, (2004) Arterioscler Thromb Vase Biol., 24:1549-1557。国际公布号WO 95/07097记载了用于治疗用途的肝素结合蛋白配制剂， 其包括肝素结合生长因子诸如VEGF及纯化的天然肝素或其它聚阴离子化合 物。肝素衍生的寡糖和各种其它聚阴离子化合物已经显示出稳定肝素结合生 长因子的活性构象(Barzu et al., (1989) J. Cell. Physiol., 140:538-548; Dabora et al.， (1991) J. Biol. Chem., 266:23627-23640)，而且肝素亲和层析已经用于各种 纯化方案(通常地参见国际公布号WO 96/02562 )。许多哺乳动物起源的肝素结合蛋白已经通过重组技术来生产，而且在临 床上是重要的(Munoz and Linhardt, (2004) Arterioscler Thromb Vase Biol., 24:1549-1557; Favard et al. (1996) Diabetes and Metabolism, 22(4):268-73; Matsuda et al., (1995) J. Biochem., 118(3):643-9; Roberts et al" (1995) Brain Research, 699(1):51-61)。例如，VEGF是血管内皮细胞的有效促细胞分裂剂。 它又称为血管通透因子(VPF)。参见Dvorak et al., (1995) Am. J. Pathol., 146:1029-39。 VEGF在血管生成(vasculogenesis)(即胚胎维管结构的发育) 和血管发生(angiogenesis)(即从原有的血管形成新血管的过程)中都扮演了 重要角色。参见例如Ferrara, (2004) Endocrine Reviews, 25(4):581-611; Risau et al" (1988) Dev. Biol., 125:441-450; Zachary， (1998) Intl. J. Biochem Cell Bio., 30:1169-1174; Neufeld et al., (1999) FASEB J., 13:9-22; Ferrara (1999) J. Mol. Med., 77:527-543; Ferrara and Davis-Smyth, (1997) Endocri. Rev., 18:4-25。 VEGF的临床应用包括那些其中新毛细血管床的生长指示为例如促进伤口愈 合的(参见例如国际公布号WO 91/02058;律师记事号P2358R1,题为"Wound Healing",于2006年6月16日提交)、促进组织生长和修复的，例如肝(参见 例如W02003/0103581 )、骨(参见例如W02003/094617 )等。还可参见Ferrara, (2004) Endocrine Reviews, 25(4):581-611。典型地，治疗上重要的重组蛋白在各种宿主生物体中生产。大多数蛋白 质可以在真核宿主诸如CHO细胞中以它们天然形式表达。动物细胞培养物通 常要求延长生长时间以实现最大细胞密度并最终获得比原核细胞培养物低 的细胞密度(Cleland, J. (1993) ACS Symposium Series 526, Protein Folding: In Vivo and In Vitro, American Chemical Society)。另夕卜，动物细胞培养物经常要 求昂贵的培养基，其包含可能干扰所需蛋白质回收的培养组分。细菌宿主表 达系统为生产规模的重组蛋白生产提供了有成本效益的替代方案。有许多关 于重组蛋白的常规细菌表达的美国专利，包括美国专利号4,565，785;4,673,641; 4,795,706; 4,710,473。该生产方法的一个主要优点是通过离心或孩t 滤容易地从细胞组分中分离产物的能力。参见例如Kipriyanov and Little, (1999) Molecular Biotechnology, 12: 173-201; Skerra and Pluckthun, (1988) Science, 240:1038-1040。重组肝素结合生长因子诸如酸性成纤维细胞生长因子、碱性成纤维细胞 生长因子和血管内皮生长因子已经从包括细菌在内的许多来源中回收和纯 化(Salter D.H. et al.， (1996) Labor. Invest.本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于从原核细胞培养物中回收肝素结合蛋白的方法，该方法包含以下步骤：　（ａ）从所述原核细胞培养物的周质中分离所述肝素结合蛋白；　（ｂ）在包含离液剂和还原剂的第一缓冲溶液中变性所述分离的肝素结合蛋白；　（ｃ）在包含离液剂和硫酸化聚阴离子试剂的第二缓冲溶液中温育所述变性的肝素结合蛋白，温育的时间和条件使得肝素结合蛋白发生重折叠；和　（ｄ）回收所述重折叠的肝素结合蛋白，其中与没有硫酸化聚阴离子试剂的温育相比回收的重折叠的肝素结合蛋白有大约２到５倍的增加。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：米歇尔D巴特勒，杰弗里L克莱兰，戴维W卡恩，谢利皮扎罗，查尔斯H施梅尔泽，玛乔丽E温克勒，
申请(专利权)人：健泰科生物技术公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]