本发明专利技术涉及一种结核分枝杆菌３８Ｋｄ－１１Ｋｄ－ＣＦＰ１０重组融合蛋白及其应用。本发明专利技术提供了一种结核分枝杆菌３８Ｋｄ－１１Ｋｄ－ＣＦＰ１０重组融合蛋白，还提供了该重组融合蛋白在制备单抗、多抗、检测试剂盒及蛋白芯片中的应用。采用本发明专利技术提供的结核分枝杆菌３８Ｋｄ－１１Ｋｄ－ＣＦＰ１０重组融合蛋白制备的结核分枝杆菌诊断试剂盒，与市场上的同类试剂盒相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，很好的满足了结核（ＴＢ）感染临床诊断的需要。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及基因工程领域，具体地涉及一种结核分枝杆菌重组融合蛋白及其应用。
技术介绍
结核病是由结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis,TB)感染所致的人类疾 病，是分支杆菌病的主要类型，主要通过呼吸道传播。自1882年德国科学家Rrobert Koch 发现TB以来，全球约有两亿人死于TB，且疫情发展日趋严重。据WHO预计，全球现有TB病 人2000万，如不控制今后10年还将有9000万人发病。我国现有3. 3亿结核菌感染者，肺 结核病人600多万，其中有严重传染性的病人150万，每年死于结核病的达25万人。因此， 结核病的预防、早期诊断和及时治疗是高度关注的课题。MTB有H37Rv与H37Ra两种标准菌 株，前者为毒力株而后者为减毒突变株，它们均来源于1934年的人肺H37分离株。与一些 临床分离株不同的是，H37Rv对药物敏感、利于基因工程操作并在TB动物模型中保留了完 整毒力，因而该菌株被广泛应用于TB相关的生物医药研究(MTb H37Rv project at Sanger Institute, NCBI)。目前常用的结核病诊断方法有胸部X光透视和主要依靠患者痰液、胸 水、支气管肺泡液的显微镜直接涂片检查(AFP)和培养法，以及分子生物学和血清学检查， 这些方法多基于高特异性的抗原建立。本专利技术提供了一种用基因工程方法生产的结核重组融合蛋白作为抗原，与常用抗 原相比特异性更强，用其作为抗原制备的免疫诊断试剂盒，可为结核病感染的检测提供更 为特异、准确的工具。
技术实现思路
(一)要解决的技术问题本专利技术的目的是提供一种结核分枝杆菌重组融合蛋白，并提供该结核分枝杆菌重 组融合蛋白在制备单抗、多抗、检测试剂盒及蛋白芯片、疫苗研究中的应用。( 二)技术方案本专利技术提供了一种编码结核分枝杆菌38Kd-llKd_CFP10重组融合蛋白的融合基 因，其核苷酸序列如SEQ ID N0:1所示。本专利技术还提供了一种结核分枝杆菌38Kd_lIKd-CFPlO重组融合蛋白，该重组融合 蛋白由所述融合基因编码，其氨基酸序列如SEQ ID N0:2所示。本专利技术提供了一种结核分枝杆菌38Kd_lIKd-CFPlO重组融合蛋白的表 达载体，该表达载体是将所述融合基因插入到质粒pET-28b上得到的重组质粒 pET-28b-38Kd-llKd-CFP10，其质粒图谱如附图1所示。本专利技术又提供了一种表达结核分枝杆菌38Kd-llKd-CFP10重组融合蛋白的 工程菌株，该工程菌株含有表达载体pET-28b-38Kd-llKd-CFP10，其宿主菌为大肠杆菌(Escherichia coli)。本专利技术还提供了一种结核分枝杆菌抗体IgG酶联免疫检测试剂盒，它包括前述的 38Kd-l IKd-CFPlO重组融合蛋白和酶标二抗，所述38Kd_l IKd-CFPlO重组融合蛋白的包被 量为0. 5-4. Oyg/孔，酶标二抗工作浓度为2. 0-16. Omg/mL。优选地，38Kd_l IKd-CFPlO重 组融合蛋白的包被量为2. 0 μ g/孔，酶标二抗工作浓度为4. Omg/mL。本专利技术提供了一种结核分枝杆菌抗体IgG诊断试剂盒，它包括TB抗原、胶体金标 记TB抗原和质控线包被兔抗TB抗体，其中所述TB抗原和胶体金标记TB抗原均是由前述 的结核分枝杆菌38Kd-lIKd-CFPlO重组融合蛋白制得。本专利技术所述的结核分枝杆菌抗体IgG诊断试剂盒，TB抗原喷点浓度为 0. 25-2. Omg/mL,胶体金标记TB抗原染色液的工作浓度为OD值50. 0-100. 0，TB抗原喷点量 为0. 5-1. 75 μ L/cm,胶体金标记TB抗原喷点量为0. 5-1. 75 μ L/cm,质控线包被兔抗TB抗 体包被浓度为0. 5-2. Omg/mL,反应膜封闭时间为45-75分钟，反应膜干燥条件为相对湿度 25% -30%下干燥30-75分钟，胶体金标记TB抗原垫干燥条件为相对湿度25% -30%下干 燥3-5小时，标本检测反应时间为15°C 30°C下反应10-30分钟，温度低于15°C时标本检 测反应时间40-50分钟。优选地，TB抗原喷点浓度为1. 0mg/mL，胶体金标记TB抗原染色液的工作浓度为OD 值80. 0，TB抗原喷点量为1. 0 μ L/cm,胶体金标记TB抗原喷点量为1. 0 μ L/cm,质控线包被 兔抗TB抗体包被浓度为1. 0mg/mL，反应膜封闭时间为60分钟，反应膜干燥条件为相对湿度 25% -30%下干燥60分钟，胶体金标记TB抗原垫干燥条件为相对湿度25% -30%下干燥4 小时，标本检测反应时间为15°C 30°C下反应25-30分钟。本专利技术还公开了所述的结核分枝杆菌38Kd-llKd_CFP10重组融合蛋白在制备单 抗、多抗及蛋白芯片中的应用。(三)有益效果采用本专利技术提供的结核分枝杆菌38Kd_lIKd-CFPlO重组融合蛋白制备的诊断试 剂盒，与市场上的同类试剂盒相比，具有特异性强、灵敏度高等优点，很好的满足了 TB感染 临床诊断的需要。附图说明图1是表达载体pET-28b-38Kd_lIKd-CFPlO的构建流程图；图2是表达载体pET-28b-38Kd-llKd-CFP10酶切产物电泳图，其中1表示DNA Marker, 2,3,4分别表示酶切后的三个阳性菌，5表示酶切前的重组质粒；图3是结核分枝杆菌38Kd_lIKd-CFPlO重组融合蛋白纯化电泳图，其中1表示细 胞裂解后的上清，2表示细胞裂解后的沉淀，3表示纯化的TB蛋白；具体实施例方式以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的保护范围。实施例1结核分枝杆菌38Kd_lIKd-CFPlO重组融合蛋白的制备1. 1基因融合通过计算机分析TB H37Rv基因组全序列，选择其强抗原表位38kDa蛋白(GENEBANK locus :YP_177770)、IlKDa 蛋白(GENEBANK locus :AAL16896)和 CFPlO 蛋白 (GENEBANK locus :BX842584)的DNA序列为模板，设计扩增引物为38kD扩增引物38-11-CFa :atcgCATATGtgtggctcgaaaccaccgagc 54. 8% Tm 79. 638-11-CFb :TCCGCAATCACCACCACCACCGCTGGAAATCGTCGCGATC 60.0% Tm 86IlkD扩增引物38-11-CFc :ggtggtggtggtGATTGCGGATCCCATGAC 60% Tm 80. 838-11-CFd :CTTCATCTCTGCCATACCACCACCACCTCCCAAGCTTCCTATGCG 56. 0% Tm 84CFPlO扩增引物38-11-CFe :ggtggtggtggtATGGCAGAGATGAAGACCGATG 50% Tm 74. 338-11-CFf :atcgCTCGAGTCAGAAGCCCATTTGCGAGG 55% Tm 79. 550mL 扩增体系ddH20 31. 5mL, IOXbuffer 5. OmL, 4XdNTP 4. OmL，上、下游引物 混液 4. O本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种编码结核分枝杆菌３８Ｋｄ－１１Ｋｄ－ＣＦＰ１０重组融合蛋白的融合基因，其特征在于：其核苷酸序列如ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１所示。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：张娟，蒋俊，董亚俊，吴雪琼，
申请(专利权)人：沈阳市胸科医院，
类型：发明
国别省市：89[中国|沈阳]
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