聚合酶链反应查结核菌标本前处理新方法技术

本发明专利技术提供一种聚合酶链反应查结核菌标本前处理新方法。该方法采用临床标本前处理试剂盒中的试剂，对临床标本进行预处理和前处理，使结核菌ＤＮＡ提取完全，将结核菌扩增前坚硬的类脂质细胞壁破坏掉，使ＤＮＡ快速释放出来，与此同时对阳性、阻性标准质控物与临床标本也一同作相应前处理，并同时进行扩增，再以标准模板对比，来分析评价每次标本前处理的质量。它操作简便，节约试剂，明显提高标本前处理质量和降低成本，可使ＰＣＲ全程结果稳定可靠。（*该技术在2012年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种从临床标本中纯化提取结核菌DNA(核糖核酸)的方法，特别是一种。目前，应用聚合酶链反应(简称PCR)检出结核菌的操作较为复杂。该方法是用耐高温的聚合酶把结核菌DNA片断扩增105-107倍后，标记荧光素电泳得出结果。其在扩增前的标本前处理阶段非常重要，它将直接影响检测结果的正确与否。现行标本前处理的方法少，不统一，试剂多，难掌握，影响PCR工作推广应用。如痰标本中粘蛋白液化不好很难清除，造成结核菌DNA提取不完全;又如结核菌扩增前需把坚硬的类脂质细胞壁破坏掉，使DNA释放出来，但传统的破壁方法采用溶菌酶，该方法步骤多，难于成功，且需时间长。另外药物被污染、空气清洁度影响等因素易引起假阴性、假阳性结果，缺少对PCR全过程的质量控制。上述诸多原因致使PCR查结核菌的结果可靠性差，易造成误诊或延误治疗时间，因此，改进标本前处理方法已势在必行。本专利技术的目的是提供一种，它操作简便，节约试剂，可使标本中结核菌DNA提取快速、完全，明显提高标本前处理质量和降低成本，确保PCR全程结果稳定可靠。本专利技术的目的是这样实现的采用临床标本进行预处理和前处理，同时对阳性标准质控物和阴性标准质控物作相应前处理，具体步骤是a、预处理将临床标本离心分离后，取上清液或沉淀物备用;b、前处理取同体积的预处理标本、阳性标准质控物、阴性标准质控物分装各试管中，在各试管中分别加入十二烷基磺酸钠液、氢氧化钠液，其体积比均为20∶1∶1，于95-100℃下水溶15-20分钟，然后在各试管中分别加入与其总体积量相同的酚/氯仿液，反复颠倒混合均匀，在4℃下高速离心10分钟后静止;静止分离后取各上层水相分移新试管中，在各试管中分别加入与水相体积相同的酚/氯仿液，再反复颠倒混合均匀，于4℃下高速离心10分钟后静止;静止分离后取各上层水相分移新试管中，在各试管中分别加入与水相体积相同的氯仿/异戊醇液，反复颠倒混合均匀，4℃下高速离心10分钟后静止;静止分离后取各上层水相分移新试管中，在各试管中先分别加入水相体积1/10的醋酸钠，再分别加入其总体2-2.5倍的无水乙醇，混匀置入-20℃下冷冻12小时以上，最后在4℃下高速离心30分钟后，弃上清液，将各沉淀物分别加入三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二钠液20-50μl，混溶沉淀待扩增。由于本专利技术直接采用配制好的置于试剂盒中的试剂，分别对各种临床进行预处理和前处理，所以既统一了试剂，简化了检定结核菌DNA分离纯化工艺，操作稳定，使DNA提取快速完全，无须专业培训即可很容易掌握，又因直接采用统一试剂，操作方便，节约试剂，故可减少试剂配制过程中的危险性，降低成本。本专利技术的方法同用溶菌酶的方法相比，具有步骤简单，明显缩短破坏结核菌坚硬的类脂质厚壁的时间，充分释放出DNA，溶菌酶方法需3-4小时，而本方法只需15-20分钟，进一步节省了试剂。特别指出的是本专利技术的方法采用标准质量控制办法检定前处理的质量好坏，明显提高标本前处理质量，从而确保PCR全程获得最理想的结果。本专利技术的方法非常适于基层防痨和医疗单位广泛应用。它以处理痰标本为主，同时还可以处理胸水、脑脊液、尿、脓汁等临床标本。利用该方法配合扩增仪就可以进行PCR检定工作，并使该项工作所用时间较原培养方法所用8-49天，平均14天，缩短为2天，它为结核病人的诊断和鉴别诊断及治疗赢得了宝贵的时间。以下结合实施方法对本专利技术作进一步说明。首先制作临床标本前处理试剂盒，即在试剂盒内将试剂按操作顺序装入相应瓶内待用。其中有T·E·N液(三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二钠、氯化钠，其体积比5∶2∶5)、DTT液(二-硫基苏糖醇)、SDS液(十二烷基磺酸钠)、NaOH液、酚/氯仿液(其体积比1∶1)、氯仿/异戊醇液(其体积比24∶1)、T·E液(三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二钠，其体积比5∶1)、NaAc液(醋酸钠)、无水乙醇。上述各试剂按量配制装入专用试剂盒内，操作时可直接使用。另外在试剂盒内还装有阴性、阳性标准质控物。其中阴性标准质控物选用T·E·N液，阳性标准质控物是将纯培养的人型结核菌以0.5%吐温80生理盐水稀释，优选出与标准模板浓度含量相一致的物品，经100℃灭菌30分钟后，冰箱储存备用。进行临床标本前处理的过程中，阴性、阳性标准质控物与标本同时处理，并一同进行扩增，再以标准模板对比，就可以以其结果分析评价每次标本前处理的质量。1、痰标本的前处理a、预处理将痰标本与T·E·N液、DTT液以体积比5∶5∶1的量置入试管中，室温下充分液化约30分钟;在80℃下水浴30分钟后，离心(3000rpm)后，10分钟取上清液备用。上清液的用量根据需要确定。b、前处理取同体积的预处理后的上清液、阳性标准质控物、阴性标准质控物分别装入试管中，在各试管中分别加入SDS液、NaOH液，其体积比均为20∶1∶1。于95-100℃下水浴15-20分钟，然后在各试管中分别加入与其总体积量相同的酚/氯仿液，反复颠倒混合均匀，在4℃下高速离心(8000-10000rpm)10分钟后静止，静止分离后取各上层水相分别移至新试管，于各试管中分别加入与水相体积相同的酚/氯仿液，再反复颠倒混合均匀，同样在4℃下高速离心10分钟后静止;静止分离后取各上层水相分别移至新试管，于各试管中分别加入水相体积相同的氯仿/异戊醇液，反复颠倒混合均匀，4℃下高速离心(8000-10000rpm)10分钟后静止，静止分离后取各上层水相分别移至新试管，于各试管中分别加入水相体积1/10的NaAc液，再分别加入其总体积的2-2.5倍的无水乙醇，混匀置入-20℃冷冻12小时以上，最后在4℃下高速离心30分钟，弃上清液，将沉淀物加入T·E液20-50μl(视沉淀物量多少而定)，混溶沉淀待扩增，即完成前处理全过程。2、脑脊液、尿标本的前处理a、预处理将脑脊液、尿标本适量离心(1000rpm)1分钟，取上清液高速离心(7000-8000rpm)10分钟静止，倒掉静止后的上清液，将沉淀物悬浮于600μlT·E液中备用。T·E液的用量可视沉淀物的多少增减。b、前处理取同体积悬浮于T·E液中的沉淀物、阳性标准质控物、阴性标准质控物分装各试管中，在各试管中分别加入SDS液、NaOH液，其体积比均为20∶1∶1，于95-100℃下水浴15-20分钟。其余操作步骤同上例痰标本的前处理的相应步骤。3、胸肤水、脓汁的前处理a、预处理将胸肤水、脓汁标本作倍量稀释，离心(1500rpm)1分钟，取上清液备用。b、前处理取同体积预处理后的上清液、阳性标准质控物、阴性标准质控物分装各试管中，在各试管中分别加入SDS液、NaOH液，其体积比均为20∶1∶1，于95-100℃下水浴15-20分钟。其余操作步骤同上例痰标本的前处理的相应步骤。本专利技术首次提出在聚合酶链反应(即PCR)查结核菌全过程中，采用阴性标准质控物和阳性标准质控物与临床标本同时进行前处理，并配以扩增仪同时进行扩增，再以标准模板(市售)对比，就可以监测临床标本前处理的质量，使PCR全程获满意之结果。下表即可从标准质控物扩增情况进行分析对比。类别结果阳性标准质控物+--+-+阴性标准质控物---++-标准模板+-++--情况分析处理扩增前处理假阳性扩增不良标准模良好不本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种聚合酶链反应查结核菌标本前处理新方法，其特征是采用临床标本进行预处理和前处理，同时对阳性标准质控物和阴性标准质控物作相应前处理，具体步骤是：ａ、预处理：将临床标本离心分离后，取上清液或沉淀物备用；ｂ、前处理：取同体积的预处理标本、阳性标准质控物、阴性标准质控物分装各试管中，在各试管中分别加入十二烷基磺酸钠液、氢氧化钠液，其体积比均为２０∶１∶１，于９５－１００℃下水溶１５－２０分钟，然后在各试管中分别加入与其总体积量相同的酚／氯仿液，反复颠倒混合均匀，在４℃下高速离心１０分钟后静止；静止分离后取各上层水相分移新试管中，在各试管中分别加入与水相体积相同的酚／氯仿液，再反复颠倒混合均匀，于４℃下高速离心１０分钟后静止；静止分离后取各上层水相分移新试管中，在各试管中分别加入与水相体积相同的氯仿／异戊醇液，反复颠倒混合均匀，４℃下高速离心１０分钟后静止；静止分离后取各上层水相分移新试管中，在各试管中先分别加入水相体积１／１０的醋酸钠，再分别加入其总体２－２．５倍的无水乙醇，混匀置入－２０℃下冷冻１２小时以上，最后在４℃下高速离心３０分钟后，弃上清液，将各沉淀物分别加入三羟甲基氨基甲烷、乙二胺四乙酸二钠液２０－５０μｌ，混溶沉淀待扩增。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张欣然，鄂晓轩，李明兰，赵华云，
申请(专利权)人：沈阳市胸科医院，
类型：发明
国别省市：89[中国|沈阳]