颗粒体蛋白-上皮素前体(GEP)抗体用于检测和抑制肝细胞癌(HCC)的用途制造技术

本发明专利技术提供检测血清ＧＥＰ水平的方法。本发明专利技术进一步提供通过检测血清ＧＥＰ水平确定患者是否患有肝细胞癌（ＨＣＣ）的方法。在另一个实施方案中，本发明专利技术提供用抗－ＧＥＰ单克隆抗体Ａ２３治疗患者从而在体外和体内均抑制ＨＣＣ生长和发展的方法。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及颗粒体蛋白-上皮素前体(GEP)及影响GEP在肝细胞 癌(HCC)中的表达、翻译和生物活性的方法。本专利技术的另一方面涉及 GEP的检测方法，其是诊断和治疗HCC的可能方法。本文以括注阿拉伯数字提到了若干出版物。这些参考文献的完整 51用可见于权利要求书之前的说明书结尾处。这些出版物的全部内容 通过引用加入到本申请中。
技术介绍
肝癌是全世界第五大常见癌症并且是第三大癌症杀手，每年大约 有50万新病例和几乎同样多的死亡人数(1,2)。肝细胞癌(HCC)是原发 性肝癌的主要组织学类型。在亚洲发生HCC的主要风险因素是乙型 肝炎病毒(HBV)感染，而在西方国家和曰本丙型肝炎病毒(HCV)感染 是主要的风险因素。患有肝细胞癌的HCC患者的预后一般较差，中 位存活时间不足l年，因为多数肝细胞癌是不可切除的，不适于新的 治疗形式，化疗有效率低。手术切除(如部分肝切除术或肝移植)对 于肝细胞癌是有疗效的治疗(3-5)。然而，仅20%的患者适合手术，因为大部分患者在肝内和/或肝外转移的晚期才#皮诊断出来。在治疗性手术之后常见复发，第一年的复发率为约50% (6)。因此，HCC的早期 检测是改善存活所必需的。开发可在无症状患者中检测出早期癌症的 血清学诊断检验应是一个重要努力方向。目前，血清曱胎蛋白(AFP)已广泛用于HCC诊断(7)。然而，用于 共存肝病患者检测HCC的血清AFP截取值还没有达成一致，所述值 的范围为10-500 ng/ml (8-10)。血清AFP检验在以常规的500 ng/ml 较高截取点使用时，在共存肝病患者中检测HCC的存在情况方面显 示出约50%的灵敏度和90%以上的特异性(9)。在以10-19 ng/ml之间 的较低截取值使用时，血清AFP检验的灵敏度为45%-100%，特异性 为70%-95% (10)。因此，为了更好地诊断HCC，迫切需要鉴定具有 更好的灵敏度和特异性的新生物标记。颗粒体蛋白-上皮素前体(GEP)(核苷酸序列SEQ ID No. 1和氨基 酸序列SEQ ID No. 2)是自分泌生长因子，属于非典型性生长因子家 族。在我们较早前的cDNA微阵列研究中报道了 HCC組织中的GEP mRNA水平明显升高(ll)。本专利技术人已在不同患者中进一步证实了该 观察结果，并证实GEP蛋白在HCC组织中被上调，但在它们的邻接 非肿瘤肝组织(肝炎和硬化肝)和正常肝中没有被上调(12)。在我们的较 早前的研究中，功能性研究表明，GEP控制HCC细胞增殖速率、侵 袭和转移(12)。由于GEP在HCC中特有地过表达且是重要的生长因 子，所以本专利技术人推测，GEP在HCC肿瘤组织中的上调应当还导致 HCC患者的血清GEP蛋白水平升高。就本专利技术人了解，不存在检测 血清GEP的测定试剂盒，因此，迄今尚未研究血清GEP水平是否具 有诊断意义。GEP在HCC中的显著升高及其增强癌细胞增殖的功能使GEP成 为引人注目的抗体治疗标耙。实际上，耙向癌症治疗相比于化疗药物 的优势在于限制了非特异性毒性并且提高了疗效，化疗药物的主要缺 点是缺乏选择性、具有严重的副作用、疗效有限和出现/选择产生耐药性(13)。随着杂交瘤技术在人源化和鼠-人嵌合单克隆抗体生产方面的 进步，可使用单克隆抗体实现靶向癌症治疗(14)。单克隆抗体(mAb) 治疗已在临床癌症治疗中^皮证实是有效的，例如用于B细胞淋巴瘤的 抗-CD20 mAB (利妥昔单抗(Rituximab))(15)、用于转移性乳腺癌的抗 -Her2 neu mAB (赫赛汀(Herceptin))(16-17)以及用于转移性结肠直肠癌 的抗-EGFR和VEGF (18,19)。然而，开发包括抗体疗法在内的用于 HCC的靶向治疗法是有限的，因此，迫切需要新的治疗标靶。迄今为止还没有寺艮道血清GEP在任何人类癌症中的诊断意义。 在本研究中，本专利技术人已测定了 HCC患者、HBV慢性携带者和健康 个体中的血清GEP水平，以利用GEP作为HCC的新诊断标记。而且， 本专利技术人还研究了新近分离的抗-GEP mAb对小鼠异种移植模型的人 HCC的抗肿瘤效力。已证实抗-GEPmAb在体外和体内均能够延迟所 建立的肿瘤的生长。这些结果表明了抗-GEP mAb在HCC治疗中的潜 在适用性。专利技术概述本专利技术人已发现，相比于肝细胞癌(HCC)患者的周围正常肝组织 和l定康个体的正常肝组织， 一种蛋白质即颗粒体蛋白-上皮素前体 (GEP)在HCC中丰富而且独特地表达。本专利技术的一个目标是提供检测血清中的GEP基因产物的药剂和 方法。本专利技术的又一个目标是提供用于诊断目的的灵敏检测HCC患 者血清中的GEP基因产物的药剂和方法。本专利技术的又一个目标是提供 用特异性GEP肽生产GEP单克隆和多克隆抗体的方法。本专利技术的又 一个目标是提供生产抗-GEP单克隆抗体(例如A23)的方法。本专利技术的 再一个目标是利用抗-GEP单克隆抗体(例如A23)抑制HCC发展。本专利技术进一步提供测定HCC患者、乙型肝炎携带者和健康个体 的GEP水平的方法和策略。为实现上述目标并且按照本专利技术的目的，正如本文具体表达并适当描述的一样，本专利技术提供针对其中表现出GEP表达改变或GEP生 物活性改变的HCC的药剂、組合物和治疗。本文使用的术语"改变的表达或者表达改变"是指相比于相应的 正常细胞或周围的正常外周细胞，GEP的表达增加或过表达或GEP 蛋白上调。术语"表达改变"还指表达不受调节，或变成组成型的而 不一定升高。本文使用的术语"改变的生物活性，，是指GEP活性的改 变，其可能是或不是GEP表达依赖性的。术语"改变的生物活性"还 指这样的情况其中GEP所赋予的任何生物功能(例如增殖、分化、 转移)的改变导致与改变的GEP表达相同或等同的状况。本文使用的术语"GEP"是指在HCC患者的HCC细胞提取物或 正常肝细胞提取物或HCC患者细胞外液体、慢性乙型肝炎携带者的 肝细胞提取物或细胞外液体、健康个体的肝细胞提取物或细胞外液体 中的颗粒体蛋白-上皮素前体。本文使用的术语"中和"是指使用抗-GEP抗体抵消GEP的活性 或作用。本文描述的"免疫组织化学，，是指使用免疫组织化学方法检测所 述HCC或正常肝或邻接的正常肝组织样品中的GEP存在情况。本文 描述的术语"免疫组织化学，，还指使用兔或小鼠抗人GEP多克隆抗体 和缀合辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗兔或山羊抗小鼠二抗以及二氨 基苯(DAB)和过氧化氢的显色检测方法。本文描述的"蛋白质印迹分析，，是指这样的方法通过凝胶电泳 由HCC样品分离提取蛋白；将分离的蛋白样品转移到膜上；用兔或 小鼠抗人GEP抗体和缀合辣根过氧化物酶(HRP)的山羊抗兔或山羊抗 小鼠二抗检测GEP;并用化学发光技术显色检测GEP。本文描述的"接受者操作特征(ROC)曲线(receiver operating characteristic curve)"用于检验在其范围内的GEP性能特征。曲线下 面积(AUC)用作整体测试性能的指标，低于0.5的参比AUC表示没有 区别能力。本文描述的所有数据都通过SPSS (用于Windows的11.0版，SPSS Inc., Chicago, IL)分析。适宜的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测生物样品中的ＧＥＰ蛋白的方法，包括以下步骤：　在包被抗－ＧＥＰ单克隆抗体的ＥＬＩＳＡ板中温育所述样品；　将所述板与抗－ＧＥＰ多克隆抗体温育；和　将所述板与缀合辣根过氧化物酶的抗兔ＩｇＧ温育；　与ＴＭＢ（３，３ ′，５，５′－四甲基联苯胺）温育；和　记录样品的光密度。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：张兆恬，何颂怡，范上达，
申请(专利权)人：香港大学，
类型：发明
国别省市：HK[中国|香港]