使用酶在ＤＮＡ中产生随机双链断裂制造技术

描述了包括单位比率小于１∶２００的非特异性核酸酶和Ｔ７　ＥｎｄｏＩ突变体的酶制剂。这种酶制剂可用于大小具有适合ＤＮＡ测序的双链ＤＮＡ片段。所述片段的末端可以根据需要容易地被修饰，以将连接物或者单独的核苷酸与双链ＤＡＮ片段的一条链连接。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】使用酶在DNA中产生随机双链断裂
技术介绍
将基因组DNA断裂成较小的不同大小的片段是在许多测序技术中重要的步骤。目前机械断裂方法，例如超声处理、自适应-聚焦声法(adaptive-focused acoustics)或者雾化，没有碱基切割偏好地产生DNA片段。但是这些方法，具有在非磷酸二酯键的地方破坏DNA的可能性，且与酶方法相比具有较低的DNA回收效率。另一方面，酶方法，例如依靠具有特定识别序列的限制性内切核酸酶的那些，产生固定的特定大小的片段，其依赖于识别序列出现的频率是可大或可小的。迄今为止，对于非特异性核酸酶的研究已经显示尽管识别和切割不需要非特异性序列，但是这些酶显示出对于在切割位点的某些碱基的偏好(Anderson Nucleic Acids Res. 9(13) :3015-27(1981) ；Herrera 禾口 Chaires J. Mol. Biol. 236(2) :405-11 (1994))。专利技术简述在本专利技术的一种实施方式中，提供了包括小于1 200单位比率的非特异性核酸酶和T7Endo I突变体的制剂。在一种实施例中，非特异性核酸酶是一种嗜盐弧菌(Vibrio vulnificus) (Vvn)核酸酶，其在Q69具有突变。在本专利技术的另一种实施方式中，提供了从大的DNA产生适合测序的片段的方法， 其包括将感兴趣的DNA与包含小于1 200单位比率的非特异性核酸酶和T7 Endo I突变体的制剂混合。大DNA被切割成大小适合测序的片段。正如上所述，在方法中使用的非特异性核酸酶的例子是Vvn核酸酶，更具体地是具有增强比活的Vvn核酸酶突变体，如在Q69 的突变。大DNA的片段可包含一个或者两个平端并可以被进一步修饰以与测序DNA使用类型的连接物(adapter)连接。附图简述附图说明图1显示使用麦芽糖-结合蛋白(MBP) -T7 Endo I突变体和ΜΒΡ-Vvn组合的DNA 断裂。CB4 是 2 体积MBP-T7 Endo I 突变体(PA/A) (0. 13 单位 / μ 1)和 1 体积MBP-Vvn (0. 14 单位/μ )的混合物。每条泳道代表30μ1反应，其中5yg基因组DNA(如在泳道的上方所指示)与3 μ 1 CB4在37°C下温育。每个反应在30分钟、60分钟和90分钟时间间隔后用15mM EDTA停止。DNA片段被乙醇沉淀和接着风干。DNA沉淀物在50 μ 1 1 X凝胶加样染料——橙色(新英格兰生物实验室公司(New England Biolabs, Inc. ), (NEB), Ipswich, MA, NEB#B7022)中再悬浮并加样在2%琼脂糖凝胶上。框指示大约100-200bps的片段。图IA显示来自海拉(宫颈腺癌)细胞、大肠杆菌(E.coli)和CpG海拉细胞 (NEB#4007)的基因组DNA的断裂。图IB显示来自鲱鱼(Herring)精子、λ噬菌体和Jurkat (人急性T-细胞白血病) 细胞基因组DNA的断裂。图2显示与两个DNA梯序列Ml-2_对数DNA梯序列(NEB#N3200，Ipswich, ΜΑ)和Μ2——NEB PCR标记物(NEB #N3234，Ipswich，ΜΑ)比较，用CB4混合物产生的DNA片段。 建立7种反应并包含3 μ 1 CB4混合物和5 μ g DNA梯序列(NEB#N3231)的每50 μ 1反应物在37°C下温育不同时间，随后用15mM EDTA以0、5、10、20、40、80和160分钟时间间隔终止。片段加样在琼脂糖凝胶上。图3A-;3B显示从30μ 1反应物中的Iyg λ DNA，在37 °C下、30分钟使用核酸酶 MBP-Vvn核酸酶(野生型(WT))或者MBP-Vvn核酸酶^)69 的连续稀释产生DNA片段。图3A 泳道M是NEB (Ipswich，MA) PCR标记物(謝3234)；泳道1-9是在泳道1中的2yg MBP-Vvn核酸酶(野生型)起始的连续2倍稀释(稀释缓冲液20mM Tris-HCl (ρΗ7· 5)、50mM NaCl、0. 15% Triton X-100 禾口 0. 1 μ g/ml BSA)。泳道 3 中使用的酶的量定义为一个凝胶单位，其中90% DNA片段小于150bp。图3B 泳道M是NEB (Ipswich，MA) PCR标记物(#3234)；泳道1-9是在泳道1中的 1. 5 μ g MBP-Vvn酶(突变体)起始的连续2倍稀释(稀释缓冲液如上)。泳道6中使用的酶的量定义为一个凝胶单位。图4显示对与由MBP-T7 Endo I突变体和MBP-Vvn核酸酶^69S) (CB4v2)组成的混合物使用不同温育时间产生的DNA片段。CB4v2是2体积MBP-T7 EndoI突变体(0. 16单位/ μ 1)禾口 1体积MBP-Vvn核酸酶(Q69S) (0. 048TCA单位/ μ 1)的混合物。每个泳道代表在37°C下与相同量的3 μ 1 CB4v2混合物一起温育的具有5 μ g不同基因组DNA (如在泳道上方所指示)的50 μ 1反应物。每个反应在30分钟、60分钟和90 分钟时间间隔后用15mM EDTA停止。DNA片段被乙醇沉淀和接着风干。DNA沉淀物在50 μ 1 IX凝胶加样染料——橙色(NEB#B7022，Ipswich, ΜΑ)中再悬浮并加样在2%琼脂糖凝胶上。框指示大约150bp片段。图5显示Vvn核酸酶0)69S)突变体的氨基酸序列(SEQ ID NO :5)。氨基酸序列从19位开始，由于信号肽(1-18)没有克隆在MBP-Vvn核酸内切酶0169S)构建物中。“*” 指示Q突变成S的69位。图6A和6B显示在分开的反应容器中使用许多不同核酸内切酶、然后断裂产物合并(图6A)和在相同反应容器中一起使用两种核酸内切酶(图6B)在时间范围上的比较。 M是2-对数DNA梯序列和C是未消化的pUC19。“_N_”指示其中pUC19的带切口形式迁移。 “-L-”指示其中pUC19的线性形式迁移。“-S-”指示其中pUC19的超螺形式迁移。图6A显示分别使用产生切口酶MBP-Vvn核酸内切酶0169S)和MBP_T7Endo I突变体的随机双链切割。8 μ g pUC19与1. 376TCA单位MBP-Vvn核酸内切酶在480 μ 1反应中温育。在另一个新管中，8 μ g pUC19与5. 6单位MBP-T7 Endo I突变体在480 μ 1反应中温育。样品在37 °C下温育。在0、5、10、15、20、30、40、和60分钟时，从每个温育混合物中移出 30μl，且通过添加EDTA(终浓度15mM)使反应停止。具有相同温育时间的样品集中在一起并加样在对应于温育时间0至60分钟的从1至8泳道的0. 8%琼脂糖凝胶上。图6B显示一起使用MBP-T7Endo I突变体和MBP-Vvn核酸内切酶核酸内切酶 (Q69S)的随机双链切割。16yg pUC与1. 376T. C. Α.单位/ μ 1的MBP-Vvn核酸内切酶 (Q69S)和5. 6单位/ μ 1ΜΒΡ-Τ7 Endo I突变体(CB4V2)在480 μ 1反应中温育。样品在 37°C下温育。本文档来自技高网...

【技术保护点】
１．制剂，其包括：小于１∶２００单位比率的非特异性核酸酶和Ｔ７　Ｅｎｄｏ　Ｉ突变体。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：谢沛仲，
申请(专利权)人：新英格兰生物实验室公司，
类型：发明
国别省市：US