用于同时检测多种耐药基因的引物探针系统、试剂盒及方法技术方案

本发明专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种用于同时检测多种耐药基因的引物探针系统、试剂盒及方法。首先，本发明专利技术公开了一种用于同时检测多种耐药基因的引物探针系统，包括核苷酸序列如SEQ ID N0：1‑24所示的核苷酸序列组。还公开了包括该引物系统的试剂盒，以及使用该引物系统或试剂盒进行耐药基因检测的方法。本发明专利技术公开的试剂盒支持高通量、快速、准确及超高灵敏度地检测6个细菌耐药基因，对中国人群进行筛查，能有效地起到准确诊断、耐药溯源、耐药控制等作用，从而减少抗生素使用量，降低耐药产生，在科研领域和临床上具有极高的应用价值。

Primer probe system, kit and method for simultaneous detection of multidrug resistance genes

【技术实现步骤摘要】
用于同时检测多种耐药基因的引物探针系统、试剂盒及方法
本专利技术属于生物医药领域，具体涉及一种用于同时检测多种耐药基因的引物探针系统、试剂盒及方法。
技术介绍
全国细菌耐药监测网的统计显示，在耐药细菌中，革兰氏阴性菌占70％左右，其中以大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、阴沟肠杆菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌为多，且多重耐药情况严重；革兰氏阳性菌占30％左右，其中，葡萄球菌属占到2/3，而金黄色葡萄球菌几乎占葡萄球菌属的一半，肠球菌属占革兰氏阳性菌的1/4左右，并以粪肠球菌和屎肠球菌为主。细菌耐药性(AntimicrobialResistance))又称抗药性，系指细菌对于抗菌药物作用的耐受性，耐药性一旦产生，药物的化疗作用就明显下降。耐药性根据其发生原因可分为获得耐药性和天然耐药性。自然界中的病原体，如细菌的某一株也可存在天然耐药性，当长期应用抗生素时，占多数的敏感菌株不断被杀灭，耐药菌株就大量繁殖，代替敏感菌株，而使细菌对该种药物的耐药率不断升高。近几十年来，随着感染性疾病的增多，伴随广谱抗生素的广泛或不合理使用，细菌的耐药情况变得日益严重，甚至产生细菌的多重耐药。感染性疾病难以控制、易复发、术后感染率高、昂贵抗菌药物使用量增加等后果日益凸显。因此对这些病原菌快速检测确定其耐药性，不仅在指导临床合理选用抗菌药有重要价值，也为预防和控制耐药细菌感染和传播提供依据，为耐药疫情监控和监测检验提供了可靠的技术手段，具有重要的现实意义。传统的病原学诊断及其耐药性检测主要依赖于形态学、培养等方法，需要先从标本中培养分离到病原菌，然后测定细菌的药物敏感性，基本以表型检测为主。其测定过程复杂，耗时长。目前，临床上也有应用全自动微生物鉴定及药敏分析系统来做耐药检测，但同样需要经历培养、分离提纯、鉴定三个步骤，最顺利的情况也需要72小时才能提供药敏结果，且难以对自身生长缓慢、生长条件苛刻的细菌进行检测。此外，血清免疫学方法也可用于细菌的耐药性检测，但其假阳性率和假阴性率高，重复性差，效能也不高。鉴于临床治疗的需要，医生往往先根据流行病学资料、临床症状、体征及影像学特征等，估计可能的病原体及药敏情况，经验性应用覆盖可能病原体的抗菌药物或者相对广谱的抗菌药物，待培养结果出来后，再对抗菌药物进行调整。综上所述，上述检测方法需要时间长，方法操作烦琐、报告结果慢、通量低，且往往先鉴定出菌种，才能相应的进行药敏等后续试验，严重限制了临床医师为患者及时有效地选择敏感抗菌药物，尤其不利于重症感染性疾病的及时治疗，而且很可能存在抗生素滥用的问题，助长了耐药菌的产生。因此开发快速高通量的分子诊断技术检测，协助快速诊断的方法，指导及时准确用药是必需和紧迫的。近年来PCR已经成为细菌耐药基因检测的常见方法，广泛应用于耐药基因的检测，弥补了药敏试验的不足，而常规PCR技术或qPCR检测技术往往只限制于单一耐药基因的的检测，要对细菌众多的耐药基因进行检测需要做大量的工作，甚至难以实现。数字PCR技术是在qPCR技术上发展起来的第三代PCR技术，理论上可以实现对单个拷贝的目标核酸片段进行扩增检测，是当前灵敏度最高的核酸检测技术。利用多色荧光数字PCR平台，结合不同荧光标记水解探针的应用，可以同时对多个目标片段进行检测。本专利专利技术了一种利用多色多重数字PCR平台同时检测多种耐药基因的试剂盒与方法。
技术实现思路
本专利技术提供的试剂盒可以在单一反应中高通量、快速、准确及超高灵敏度地检测6个细菌耐药基因，对中国人群进行筛查，能有效地起到准确诊断、耐药溯源、耐药控制等作用，从而减少抗生素使用量，降低耐药产生，在科研领域和临床上具有极高的应用价值。具体的，本专利技术的技术方案如下：本专利技术第一个方面公开了一种用于同时检测多种耐药基因的引物探针系统，包括：用于检测blaKPC基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQIDN0：1、SEQIDN0：2和SEQIDN0：3所示；用于检测mecA基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQIDN0：4、SEQIDN0：5和SEQIDN0：6所示；用于检测vanA基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQIDN0：7、SEQIDN0：8和SEQIDN0：9所示；用于检测vanB基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQIDN0：10、SEQIDN0：11和SEQIDN0：12所示；用于检测vanM基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQIDN0：13、SEQIDN0：14和SEQIDN0：15所示；用于检测OXA-48-like基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQIDN0：16、SEQIDN0：17和SEQIDN0：18所示；用于检测blaNDM基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQIDN0：19、SEQIDN0：20和SEQIDN0：21所示；用于检测mcr-1基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQIDN0：22、SEQIDN0：23和SEQIDN0：24所示。应当理解，与上述核苷酸序列具有90％以上同源性且功能相同的核苷酸序列变体，均在本专利技术的保护范围之内。其中，blaKPC基因为碳青霉烯酶基因；mecA基因为耐甲氧西林葡萄球菌携带的耐药基因；van基因为万古霉素耐药基因型，vanA/B/M为其中的3种基因；OXA型基因为碳青酶烯酶基因型，OXA-48-like为其中的一种基因；blaNDM基因为肠杆菌科细菌对碳青霉烯类抗菌药物的耐药基因；mcr-1基因为多黏菌素耐药基因。本专利技术第二个方面公开了上述的引物探针系统制备的用于同时检测多种耐药基因的产品。进一步的，所述产品为试剂盒。更进一步的，所述试剂盒包括检测试剂。本专利技术还公开了一种同时检测多种耐药基因的方法，所述方法使用上述的引物系统或上述的产品进行检测。进一步的，基于多重数字PCR平台进行检测。术语“多重数字PCR”是指在同一数字PCR反应体系里加上两对或两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的数字PCR反应。将多重PCR技术与数字PCR技术有机结合而形成的多重数字PCR，根据DNA探针不同荧光度、DNA扩增不同循环数及多种标记荧光同时使用，便可大幅提高数字PCR多重性，多重性可达20-50以上，即同时在一个PCR反应单元内进行20-50个以上的数字PCR反应。进一步的，上述方法包括以下步骤：(1)提取样本核酸；(2)配置数字PCR反应液；(3)制备液滴芯片；(4)运行液滴芯片扩增程序后，采用生物芯片阅读仪进行分析后报告输出。需要强调的是，根据本专利技术的教导，本领域技术人员有能力选择合适的方法，而不限于如上描述的方案。进一步的，检测样品为阳性细菌培养物或感染患者血浆样品。通过常规试剂盒提取临床样品血浆中的游离核酸，并用液滴数字PCR系统进行检测。进一步的，所述扩增程序包括：95℃预变性10min；95℃变性15秒，60℃退火60秒，循环40次。本专利技术还公开了上本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于同时检测多种耐药基因的引物探针系统，其特征在于，包括：/n用于检测blaKPC基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：1、SEQ ID N0：2和SEQ ID N0：3所示；/n用于检测mecA基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：4、SEQ ID N0：5和SEQ ID N0：6所示；/n用于检测vanA基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：7、SEQ ID N0：8和SEQ ID N0：9所示；/n用于检测vanB基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：10、SEQ ID N0：11和SEQ ID N0：12所示；/n用于检测vanM基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：13、SEQ ID N0：14和SEQ ID N0：15所示；/n用于检测OXA-48-like基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：16、SEQID N0：17和SEQ ID N0：18所示；/n用于检测blaNDM基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：19、SEQ ID N0：20和SEQ ID N0：21所示；/n用于检测mcr-1基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQ ID N0：22、SEQ ID N0：23和SEQ ID N0：24所示。/n...

【技术特征摘要】
1.一种用于同时检测多种耐药基因的引物探针系统，其特征在于，包括：
用于检测blaKPC基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQIDN0：1、SEQIDN0：2和SEQIDN0：3所示；
用于检测mecA基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQIDN0：4、SEQIDN0：5和SEQIDN0：6所示；
用于检测vanA基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQIDN0：7、SEQIDN0：8和SEQIDN0：9所示；
用于检测vanB基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQIDN0：10、SEQIDN0：11和SEQIDN0：12所示；
用于检测vanM基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQIDN0：13、SEQIDN0：14和SEQIDN0：15所示；
用于检测OXA-48-like基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQIDN0：16、SEQIDN0：17和SEQIDN0：18所示；
用于检测blaNDM基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQIDN0：19、SEQIDN0：20和SEQIDN0：21所示；
用于检测mcr-1基因的引物组和探针的核苷酸序列分别如SEQIDN0：22、SEQIDN0：23和SEQIDN0：24所示。


2.由权利...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱留伟，董德坤，夏江，
申请(专利权)人：领航基因科技杭州有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33