HOXD9在外周神经损伤后的表达量检测方法及HOXD9基因的应用技术

本发明专利技术提供一种HOXD9在外周神经损伤后的表达量检测方法，包括如下步骤：（1）通过分离大鼠坐骨神经损伤后不同时间点的背根神经节神经元核蛋白，进行转录因子活性检测，确定转录因子HOXD9在神经再生过程中表达量变化趋势；（2）应用PCR技术，观察HOXD9的相关信使RNA结果表达量及表达趋势；（3）采用免疫荧光染色方法，在DRG神经元中显示HOXD9的胞内定位；（4）统计坐骨神经损伤后不同时间点的HOXD9荧光强度变化趋势，在3天时荧光强度达到最亮，与PCR实验获得的结果趋势一致。本发明专利技术明确了HOXD9在外周神经损伤后的表达量变化，发现了HOXD9对神经元轴突再生的调节作用。

Detection of HOXD9 expression after peripheral nerve injury and application of HOXD9 gene

【技术实现步骤摘要】
HOXD9在外周神经损伤后的表达量检测方法及HOXD9基因的应用
本专利技术属于神经科学基础医学领域，具体涉及一种HOXD9在外周神经损伤后的表达量检测方法及HOXD9基因的应用。
技术介绍
HOX（homebox，同源盒基因）基因家族包括四个基因簇：HOXA，HOXB，HOXC，HOXD。其中，HOXD9基因在脊椎和上肢发育过程中起到了重要作用，在如肾脏、睾丸、结肠、脾脏、胎盘和膀胱等组织中均存在高表达。HOXD9在肝细胞癌研究中表现为原癌基因的作用，对于癌细胞的迁移和入侵具有促进作用。HOXD9表达下调则会导致在多种癌症中的DNA启动子高度甲基化从而影响肿瘤预后。然而，HOXD9在神经损伤及修复中的作用及机制尚不明确。
技术实现思路
本专利技术要解决的技术问题是提供一种HOXD9在外周神经损伤后的表达量检测方法及HOXD9基因的应用，明确HOXD9在外周神经损伤后的表达量变化，发现了HOXD9对神经元轴突再生的调节作用。为解决上述技术问题，本专利技术的实施例提供一种HOXD9在外周神经损伤后的表达量检测方法，包括如下步骤：（1）通过取不同时间点坐骨神经夹伤的SD大鼠L4-6背根神经节，置于无Ca2+/Mg2+-HibernateA中，剪去多余组织后转入1mg/mL胶原酶中，37℃消化90min，再用0.25%胰酶37℃消化15min，加入终止液终止反应，用1mL枪头吹打，充分混匀，离心，900rpm×5min；弃上清，15%BSA离心2次，900rpm×5min；弃上清，加入培养基，混匀细胞，过200目筛网，最后得到较纯的DRG神经元；将细胞快速冻存，待所有时间点收齐后，进行核蛋白分离和转录因子活性检测，确定转录因子HOXD9在神经再生过程中表达量变化趋势；（2）应用PCR技术，观察HOXD9的相关信使RNA结果表达量及表达趋势；（3）采用免疫荧光染色方法，在DRG神经元中显示HOXD9的胞内定位；（4）统计坐骨神经损伤后不同时间点的荧光强度变化趋势，3天时荧光强度达到最亮，与PCR实验获得的结果趋势一致。其中，步骤（1）中的时间点包括0h、15min、30min、3h、12h、1d和3d。其中，步骤（1）中所用终止液为含10%FBS的PBS溶液。其中，步骤（1）中SD大鼠的重量为180～220g。本专利技术还提供一种HOXD9基因的应用，用于制备促神经再生药物。本专利技术的上述技术方案的有益效果如下：本专利技术明确了HOXD9在外周神经损伤后的表达量变化，发现了HOXD9对神经元轴突再生的调节作用。附图说明图1为本专利技术中坐骨神经夹伤后不同时间点HOXD9表达量变化图；图2为本专利技术中HOXD9Cas9-CKO小鼠纯合子注射病毒后坐骨神经夹伤透明化染色结果图。具体实施方式为使本专利技术要解决的技术问题、技术方案和优点更加清楚，下面将结合附图及具体实施例进行详细描述。实施例1本专利技术提供了一种HOXD9在外周神经损伤后的表达量检测方法，包括如下步骤：（1）通过取不同时间点（0h，15min，30min，3h，12h，1d，3d）坐骨神经夹伤的SD大鼠（180～220g）L4-6背根神经节，置于无Ca2+/Mg2+-HibernateA中，剪去多余组织后转入1mg/mL胶原酶中，37℃消化90min，再用0.25%胰酶37℃消化15min（每5min轻轻吹打组织，使其充分消化），加入终止液（含10%FBS的PBS）终止反应，用1mL枪头吹打，充分混匀，离心，900rpm×5min；弃上清，15%BSA离心2次，900rpm×5min；弃上清，加入培养基，混匀细胞，过200目筛网，最后得到较纯的DRG神经元，将细胞快速冻存；待所有时间点收齐后，送武汉中帜生物有限公司进行核蛋白分离和转录因子活性检测，确定转录因子HOXD9在神经再生过程中表达量变化趋势；（2）应用PCR技术（PolymeraseChainReaction，聚合酶链式反应），观察HOXD9的相关信使RNA（messageRNA，mRNA）结果表达量及表达趋势；（3）采用免疫荧光染色方法，在DRG神经元中显示HOXD9的胞内定位；（4）统计坐骨神经损伤后不同时间点的荧光强度变化趋势，3天时荧光强度达到最亮，与PCR实验获得的结果趋势一致。具体实验步骤和结果如下所述：通过分离大鼠坐骨神经损伤后不同时间点的背根神经节(Dorsalrootganglion,DRG)神经元核蛋白，进行转录因子活性检测，发现转录因子HOXD9在神经再生过程中表达量逐步升高，在3天达到峰值，之后下降（如图1A）；其蛋白水平表达变化与信使RNA（messageRNA，mRNA）结果基本一致（如图1B）。免疫荧光染色显示HOXD9主要定位在DRG神经元的胞浆中。损伤后不同时间点的荧光强度变化趋势亦与我们之前实验获得的结果一致，3天时荧光强度达到最亮（如图1C）。图1中，标尺=50μm。实施例2本专利技术还提供一种HOXD9基因的应用，可用于制备促神经再生药物，也可用于研究HOXD9在神经损伤及修复中的作用及机制，明确干预HOXD9的表达是否会影响神经再生修复。具体实验步骤和结果如下所述：委托南京大学模式动物所构建HOXD9Cas9-CKO小鼠，将从武汉枢密脑科学技术有限公司购得的病毒PFD-rAAV-CMV-Cre-WPRE-pA（AAV2/9型）及其对照病毒鞘内注射入纯合的Hoxd9Cas9-CKO小鼠体内，3周以后进行坐骨神经夹伤，3天后灌注取坐骨神经透明化，STMN2染色标记再生轴突（如图2）。发现HOXD9选择性敲除的实验组小鼠坐骨神经损伤后再生的轴突长度较对照组有明显缩短，提示干扰HOXD9的表达可以影响坐骨神经损伤后的轴突再生。图2中，图2A为病毒鞘内注射流程图，图2B为坐骨神经夹伤3天后取坐骨神经透明化，STMN2（即SCG10）染色后示再生轴突生长情况示意图。图2中，标尺=500μm。以上所述是本专利技术的优选实施方式，应当指出，对于本
的普通技术人员来说，在不脱离本专利技术所述原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本专利技术的保护范围。本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种HOXD9在外周神经损伤后的表达量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：/n（1）通过取不同时间点坐骨神经夹伤的SD大鼠L4-6背根神经节，置于无Ca

【技术特征摘要】
1.一种HOXD9在外周神经损伤后的表达量检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）通过取不同时间点坐骨神经夹伤的SD大鼠L4-6背根神经节，置于无Ca2+/Mg2+-HibernateA中，剪去多余组织后转入1mg/mL胶原酶中，37℃消化90min，再用0.25%胰酶37℃消化15min，加入终止液终止反应，用1mL枪头吹打，充分混匀，离心，900rpm×5min；弃上清，15%BSA离心2次，900rpm×5min；弃上清，加入培养基，混匀细胞，过200目筛网，最后得到较纯的DRG神经元；将细胞快速冻存，待所有时间点收齐后，进行核蛋白分离和转录因子活性检测，确定转录因子HOXD9在神经再生过程中表达量变化趋势；
（2）应用PCR技术，观察HOXD9的相关信使RNA结果表达量及表达趋势；
（3）采用免疫荧光染色...

【专利技术属性】
技术研发人员：周松林，徐灵驰，秦婧，于彬，顾晓松，
申请(专利权)人：南通大学，
类型：发明
国别省市：江苏;32