本发明专利技术公开了本发明专利技术描述了基于恒温扩增与基因编辑的数字微流控芯片的核酸检测方法，所述方法包含以下试剂和步骤，包括：将待测样品的核酸、恒温扩增混合液以及基因编辑核酸检测液同时注入数字微流控芯片中相对应的位置；接着启动程序通过电流自动驱动液滴，使待检测样品的核酸液滴先与恒温扩增混合液的液滴混合并在芯片上反复流动混匀，在37‑42℃，10‑15分钟来进行核酸恒温扩增；随后将基因编辑核酸检测液的液滴通过电流自动驱动，并与上述混合液滴混匀，在37℃反应10‑30分钟后用荧光探测装置，从而推断目的核酸的有无；该方法显示出恒温下高灵敏度和快速检测的巨大潜能，整个检测过程缩短在1小时之内，自动化程度高，不涉及开盖，杜绝气溶胶污染。
Nucleic acid detection method of digital microfluidic chip based on constant temperature amplification and gene editing
【技术实现步骤摘要】
基于恒温扩增与基因编辑的数字微流控芯片的核酸检测方法
本专利技术涉及分子生物学领域，特别涉及基于恒温扩增与基因编辑的数字微流控芯片的核酸检测方法。
技术介绍
随着科学技术日新月异，目前越来越多的高自动化仪器平台被专利技术用于解放人力、代替人类工作。数字微流控技术基于由液体表面张力引起的液滴生成，运用电场产生液体表面的极性亲水性，使液滴变平，通过电荷与电场梯度控制极化位置以生成张力梯度，使受控液滴在微流控平台表面发生移动。通过在一系列步骤中一系列层次组合并重复多次操作，得以实现复杂的实验程序自动化。数字微流控平台的通常由介电材料(如玻璃)构成，其底层为电极，负责电荷和电场梯度的积累，顶层通常涂有疏水层，用以在微滴接触点处生成低表面能。当施加电压时，电极被激活，通过沿着电极线的电荷与电场梯度变化来操纵液滴。数字微流控技术，也称之为芯片技术，在生命科学研究领域拥有众多优势。包括其在便携性方面的高潜力，可提供高通量高自动化的检测平台以及稀有或昂贵试剂或样品消耗量的显著减少。数字微流控技术已经应用于创建免疫测定装置，数字微流控技术通过自动递送、混合、培养和洗涤芯片上的分析物，极大地简化并扩展了复杂的实验程序。而高度自动化，快速，灵敏的核酸检测可以应用于诸多方面，例如对流行性的病原体检测，体检中对特定基因的检测，分辨基因分型，以及各种实验室的研究任务。对预防传染病的传播，疾病的早期筛查，以及加快实验室的实验进度有着重大意义。目前核酸检测的方法还停留在实时荧光定量PCR的方法，耗费时间长，步骤十分复杂，且成本较高。实时荧光定量PCR方法需要对温度进行设置，从而限制了其使用范围。同时，实时荧光定量PCR的灵敏度达不到单拷贝检出，很可能漏检极微量的核酸，同时操作中开盖会造成十分严重的气溶胶污染，对接下来的检测造成假阳性的干扰。因此，为解决目前核酸检测耗费时间长，步骤复杂，成本较高且可能漏检极微量的核酸等问题，本专利技术提供了一种基于恒温扩增与基因编辑的数字微流控芯片的核酸检测方法。
技术实现思路
专利技术的目的在于提供一种基于恒温扩增与基因编辑的数字微流控芯片的核酸检测方法，解决了目前核酸检测耗费时间长，步骤复杂，成本较高且可能漏检极微量的核酸等问题。本专利技术是这样实现的，本专利技术描述了一种在数字微流控(Digitalmicrofluidics,DMF)芯片平台上结合恒温扩增与基因编辑技术进行核酸检测的方法，所述方法包含以下试剂和步骤，包括：将待测样品的核酸、恒温扩增混合液以及基因编辑核酸检测液同时注入数字微流控芯片中相对应的位置；接着启动程序通过电流自动驱动液滴，使待检测样品的核酸液滴先与恒温扩增混合液的液滴混合并在芯片上反复流动混匀，在37-42℃，10-15分钟来进行核酸恒温扩增；随后将基因编辑核酸检测液的液滴通过电流自动驱动，并与上述混合液滴混匀，在37℃反应10-30分钟后用荧光探测装置，如荧光显微镜、蓝光、紫外灯等探测芯片上混合液滴的荧光，从而推断目的核酸的有无。所述操作系统中，数字微流控平台包含数字微流控仪器，芯片，以及电脑端控制软件。芯片由两部分组成，分别为上极板和下极板。上极板为玻璃材质，其中一面覆盖一层氧化铟锡(ITO)膜以及特氟龙形成的疏水层；下极板基底材质为玻璃，上面依次覆盖金属铬电极、保护电极的介质层、特氟龙形成的疏水层。上极板与下极板之间距离约360um，用硅油填充缝隙。所述的待测核酸为DNA或RNA。所述的恒温扩增混合液包括：重组酶，辅助蛋白，单链DNA结合蛋白，DNA聚合酶，正向引物，反向引物以及反应缓冲液。如果模板是RNA核酸扩增反应溶液还需要逆转录酶。其中逆转录酶将RNA转化为DNA，前后引物，uvsX蛋白，uvsY蛋白，gp32蛋白保证了核酸的恒温扩增，从而增加了被基因编辑酶Cas12a蛋白识别的概率。进一步地，所述的恒温扩增混合液包括：80-600ng/ul重组酶T4噬菌体uvsX蛋白或大肠杆菌RecA，20-380ng/ul辅助蛋白T4噬菌体uvsY蛋白，200-800ng/ul单链结合蛋白gp32，10-300ng/ulDNA聚合酶，0.2-0.6uM正向引物，0.2-0.6uM反向引物以及反应缓冲液。如果模板是RNA核酸扩增反应溶液还需要10-600ng/ul逆转录酶。所述的反应缓冲液包括：MgAc，Tris-HCl，DTT，聚乙二醇，乙酸钾，ATP，dNTPs，磷酸肌酸，肌酸激酶。进一步地，所述的反应缓冲液包括：5-20mMMgAc，20-200mMTris-HCl，1-10mMDTT，4-12％(w/v)聚乙二醇，20-100mM乙酸钾，1-20mMATP，0.1-4mMdNTPs，10-100mM磷酸肌酸，10-80ug/U肌酸激酶,缓冲液的PH值为7.5-8.5。所述的基因编辑核酸检测液包括：引导RNA(crRNA)，荧光探针，基因编辑酶Cas12a蛋白。进一步地，所述的基因编辑核酸检测液包括：100-800nM引导RNA(crRNA)，10-400nM荧光探针，50-500ng/ul基因编辑酶Cas12a蛋白。其中，基因编辑酶为Cas12a蛋白来自于毛螺菌科细菌：LachnospiraceaebacteriumND2006。经基因工程将Cas12a蛋白基因克隆到大肠杆菌中进行大量提纯。所述的荧光探针，其碱基长度为5，序列为TTATT或TCCCT或TTCTT，一端含有荧光基团修饰：5-FAM或FITC，另一端含有淬灭基团修饰：BHQ1或TAMRA。进一步地探测荧光的装置，可以为荧光显微镜、蓝光、紫外灯或其他任何能够读取芯片上荧光的仪器。本专利技术的有益效果：本专利技术采用的方法显示出恒温下高灵敏度和快速检测的巨大潜能，且结合数字微流控平台将整个检测过程缩短在45分钟之内，检测全程高度自动化，反应全部在芯片内，不涉及开盖，杜绝气溶胶污染。并且微流控芯片所需的无论是待测样本的核酸、酶或反应液都是极其微量的，极大的降低了核酸检测的成本。解决了目前核酸检测耗费时间长，步骤复杂，成本较高且可能漏检极微量的核酸等问题。附图说明图1是本专利技术提供的微流控芯片极板对应位置示意图；图2是本专利技术提供的基于恒温扩增与基因编辑的数字微流控芯片的核酸检测流程示意图；图3是本专利技术提供的检测鼻咽拭子样本中肺炎支原体DNA的结果图；图4是本专利技术提供的检测呼吸道分泌物中甲型与乙型流感病毒RNA的结果图；图5是本专利技术提供的检测血清中乙型肝炎病毒DNA的结果图；图6是本专利技术提供的检测植物中烟草花叶病毒RNA的结果图；图7是本专利技术检测呼吸道分泌物中甲型流感病毒灵敏度的结果图；图8是对照运用实时荧光定量PCR检测呼吸道分泌物中甲型流感病毒灵敏度的结果图。具体实施方式以下通过特定的具体实例说明本专利技术的实施方式，本领域技术人员可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本专利技术的其他优点与功效。本专利技术还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.基于恒温扩增与基因编辑的数字微流控芯片的核酸检测方法，其特征在于：该检测方法包括以下步骤：/n步骤一、将待测样品的核酸、恒温扩增混合液以及基因编辑核酸检测液同时注入数字微流控芯片中相对应的位置；/n步骤二、启动程序，通过电流自动驱动液滴，使得待测样品的核酸的液滴与恒温扩增混合液混合并在芯片上反复流动混匀，在37-42℃下进行核酸恒温扩增10-15min；/n步骤三、将基因编辑核酸检测液的液滴通过电流驱动，并与步骤二中混合后的液体混匀，37℃条件下反应10-30min，用荧光探测装置探测数字微流控芯片上的混合液滴的荧光。/n
【技术特征摘要】
1.基于恒温扩增与基因编辑的数字微流控芯片的核酸检测方法，其特征在于：该检测方法包括以下步骤：
步骤一、将待测样品的核酸、恒温扩增混合液以及基因编辑核酸检测液同时注入数字微流控芯片中相对应的位置；
步骤二、启动程序，通过电流自动驱动液滴，使得待测样品的核酸的液滴与恒温扩增混合液混合并在芯片上反复流动混匀，在37-42℃下进行核酸恒温扩增10-15min；
步骤三、将基因编辑核酸检测液的液滴通过电流驱动，并与步骤二中混合后的液体混匀，37℃条件下反应10-30min，用荧光探测装置探测数字微流控芯片上的混合液滴的荧光。
2.根据权利要求1所述的基于恒温扩增与基因编辑的数字微流控芯片的核酸检测方法，其特征在于：所述待测样品的核酸为DNA或RNA。
3.根据权利要求1-2任意一项所述的基于恒温扩增与基因编辑的数字微流控芯片的核酸检测方法，其特征在于：所述的恒温扩增混合液包括：重组酶，辅助蛋白，单链DNA结合蛋白，DNA聚合酶，正向引物，反向引物以及反应缓冲液，
如果模板是RNA，所述的恒温扩增混合液还包括逆转录酶。
4.根据权利要求3所述的基于恒温扩增与基因编辑的数字微流控芯片的核酸检测方法，其特征在于：所述重组酶为80-600ng/ul重组酶T4噬菌体uvsX蛋白或大肠杆菌RecA，所述辅助蛋白为20-380ng/ul辅助蛋白T4噬菌体uvsY蛋白，所述单链DNA结合蛋白为200-800ng/ul单链结合蛋白gp32，所述DNA聚合酶为10-300ng/ulDNA聚合酶，所述正向引物为0.2-0.6uM，所述反向引物为0.2-0.6uM，所述逆转录酶为10-600ng/ul。
5.根据权利要求3所述的基于恒温扩增与基因编辑的数字微流控芯片的核酸检测方法，其特征在于：所述的反应缓冲液包括：5-20mMMgAc，20-200mMTris-HCl，1-10mMDTT...
【专利技术属性】
技术研发人员：李博安，杨朝勇，张睿，孙珍，林康凤，郭剑光，洪欣欣，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建;35
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