检测碳青霉烯酶blaKPC基因的引物、方法及试剂盒技术

本发明专利技术属于分子生物学技术领域，具体涉及一种检测碳青霉烯酶blaKPC基因亚型的引物、方法及试剂盒。本发明专利技术提供了一组可特异性扩增碳青霉烯酶blaKPC所有基因亚型的引物；并在其基础上设计了相应的检测方法和试剂盒。本发明专利技术检测碳青霉烯酶blaKPC基因亚型的试剂盒和方法具有快速、准确、操作简单等特点，可以涵盖blaKPC基因家族的所有基因亚型；检测特异性强，与其它非目的基因或人源基因无交叉反应；灵敏度高，按照质粒拷贝数确定的最低检测限为每个反应100个拷贝。本发明专利技术可用于体外定量检测耐碳青霉烯酶blaKPC家族所有基因型，为临床确定抗感染提供理论依据，并为碳青霉烯酶分子流行病学研究提供参考方法。

Primers, methods and kits for detection of blakpc gene of carbapenemase

【技术实现步骤摘要】
检测碳青霉烯酶blaKPC基因的引物、方法及试剂盒
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种检测碳青霉烯酶blaKPC基因的引物、方法及试剂盒。
技术介绍
碳青霉烯类抗生素(Carbapenems)属于β-内酰胺类抗生素家族中的一员，对质粒介导的超广谱β-内酰胺酶(Extendedspecturnβ-lactamerses,ESBLs)、染色体及质粒介导的头孢菌素酶均具有高度稳定性，曾被认为是紧急治疗抗药性病症的重要方法。然而，随着近几年该类抗生素的广泛应用，临床出现越来越多的碳青霉烯类抗生素耐药菌株，包括鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌以及近年来报道的细菌等。在β-内酰胺类抗生素家族中，碳青霉烯类抗生素能够抑制或者抵抗绝大多数细菌β-内酰胺酶的水解。碳青霉烯酶根据其氨基酸序列可分为两种类，其中B亚型包含锌指结构，故又简称为金属酶，A、C、D亚型在酶活性位点上含有丝氨酸又称为丝氨酸酶。编码A类基因位于质粒或者染色体上，目前主要有KPC、SME、IMI、NMC、GES、SHV-38等，其中KPC酶临床上最为常见。KPC基因上游序列的不稳定性导致其产生多种异构体，至今已发现40余种KPC酶。产KPC酶的细菌多为肠杆菌科细菌，其中以肺炎克雷伯菌居多，因多重耐药导致产KPC酶细菌容易造成人体系统性感染。产KPC酶的及时检测有助于临床快速诊疗。目前用于碳青霉烯酶的检测方法主要包括以下两方面：一是基于该类酶对碳青霉烯类抗生素水解作用的表型鉴定方法；二是基于碳青霉烯酶编码基因的分子生物学检测方法。表型鉴定方法包括美国临床实验室标准化委员会(CLSI)推荐的改良Hodge试验(ModifiedHodgeTest，MHT)、碳青霉烯酶活性抑制试验以及含碳青霉烯类抗生素的显色培养基分离培养法。该类方法均依赖于菌株的分离培养，操作繁琐、费时较长，且无法明确菌株分子流行病学特征。分子生物学检测方法包括基于杂交技术的基因芯片检测方法、基于核酸扩增的单重PCR、LAMP技术、多重PCR和实时荧光定量PCR技术以及二代测序技术。基因芯片方法具有快速，自动化程度高，敏感性及特异性高等优点；但该方法仅针对有限数量的已知基因型，无法检测新出现酶的基因型及基因亚型，且仪器设备和试剂成本昂贵，一般实验室无法作为常规工作开展。传统单重PCR结合琼脂糖凝胶电泳和基因测序技术是目前确定碳青霉烯酶基因型的金标准，但是该法工作量大，易因开盖检测导致PCR产物污染，而出现假阳性，不适用于大规模临床检测和流行病学调查。传统实时荧光定量PCR或LAMP技术均可通过扩增过程中荧光变化产生的扩增曲线来判断待测基因型的存在与否及含量，但因扩增片段长度一般限制在200bp左右，该法仅限于检测有限数量的已知基因型，无法覆盖到同一家族所有基因型或基因亚型。细菌全基因组或质粒测序可直观地研究碳青霉烯酶基因的基因型及位置，并可发现新的基因型。但该法操作复杂，价格昂贵，不适合大规模临床标本检测，目前仅限于实验室科学研究阶段。
技术实现思路
本专利技术旨在至少解决现有技术中存在的技术问题之一，为此，本专利技术提供了一种实时、准确、快速，可以检测碳青霉烯酶blaKPC基因家族所有基因亚型的引物、方法及试剂盒。因此，本专利技术的目的之一在于提供一种检测碳青霉烯酶blaKPC基因亚型的引物。本专利技术的另一目的在于提供一种检测碳青霉烯酶blaKPC基因亚型的试剂盒。本专利技术的又一目的在于提供一种检测碳青霉烯酶blaKPC基因亚型的方法。本专利技术的又一目的在于提供一种上述引物或试剂盒在检测携带blaKPC基因耐药菌中的应用。本专利技术所采用的技术方案如下文所述。本专利技术的一种检测碳青霉烯酶blaKPC基因亚型的引物，包括如下所示序列：KPC-F3：GAATATCGTTGATGTCACTG；KPC-R3：AGATGATTTTCAGAGCCTTA。在本专利技术的一些实施例中，如上所述引物可以由本领域常规技术手段合成。进一步地，所述碳青霉烯酶blaKPC基因亚型包括：blaKPC-1、blaKPC-2、blaKPC-3、blaKPC-4、blaKPC-5、blaKPC-6、blaKPC-7、blaKPC-8、blaKPC-9、blaKPC-10、blaKPC-11、blaKPC-12、blaKPC-13、blaKPC-14、blaKPC-15、blaKPC-16、blaKPC-17、blaKPC-18、blaKPC-19、blaKPC-20、blaKPC-21、blaKPC-22、blaKPC-23、blaKPC-24、blaKPC-25、blaKPC-26、blaKPC-27、blaKPC-28、blaKPC-29、blaKPC-30、blaKPC-31、blaKPC-32、blaKPC-33、blaKPC-34、blaKPC-35、blaKPC-36、blaKPC-37、blaKPC-38、blaKPC-39、blaKPC-40、blaKPC-41、blaKPC-42、blaKPC-43、blaKPC-44、blaKPC-45、blaKPC-46。在本专利技术的一些实施例中，所述引物用来特异性扩增含碳青霉烯酶blaKPC基因亚型的全序列。本专利技术还提供一种如上所述的引物在制备检测携带碳青霉烯酶blaKPC基因亚型的细菌的试剂中的用途。进一步地，所述检测包括：1)从样品中提取DNA；2)以提取的DNA为模板，用如权利要求1～3中任一项所述的引物进行PCR扩增反应；3)对待测样品中的碳青霉烯酶blaKPC基因亚型进行结果分析。进一步地，所述PCR扩增反应为实时定量PCR反应。这些引物可在用于检测样品中碳青霉烯酶blaKPC基因亚型的方法或制备相关试剂中使用，所述碳青霉烯酶基因的存在表明所述样品中包含具有碳青霉烯酶blaKPC基因抗性的细菌。本专利技术还提供一种检测碳青霉烯酶blaKPC基因亚型的试剂盒，所述试剂盒包括如上所述引物。进一步地，所述试剂盒还包括：阳性对照品进一步地，所述阳性对照品为携带blaKPC全序列的质粒。进一步地，所述质粒是使用pET28a载体构建的携带blaKPC全序列的克隆质粒。进一步地，所述质粒的核酸序列与blaKPC-4一致性为100％，GenBankaccessionnumbers:MK816391。进一步地，所述试剂盒还包括：阴性对照品。进一步地，所述阴性对照品为灭菌双蒸水。进一步地，所述试剂盒还包括：2×SYBRGreenPCRMasterMix、标准品、和无核酸酶去离子水。进一步地，所述2×SYBRGreenPCRMasterMix包含Taq酶、dN(U)TP、10×PCRBuffer、SYBRGreen荧光染料、MgCl2、UNG酶的混合液。进一步地，所述标准品为：pET28a-blaKPC阳性克隆质粒，标准品浓度分别为108、107、106、105copies/ml。本专利技术还提供一种非诊本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种检测碳青霉烯酶blaKPC基因亚型的引物，其特征在于，包括如下所示序列：/nKPC-F3：GAATATCGTTGATGTCACTG；/nKPC-R3：AGATGATTTTCAGAGCCTTA。/n

【技术特征摘要】
1.一种检测碳青霉烯酶blaKPC基因亚型的引物，其特征在于，包括如下所示序列：
KPC-F3：GAATATCGTTGATGTCACTG；
KPC-R3：AGATGATTTTCAGAGCCTTA。


2.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述引物用来特异性扩增含碳青霉烯酶blaKPC基因亚型的全序列。


3.根据权利要求1所述的引物，其特征在于，所述碳青霉烯酶blaKPC基因亚型包括：blaKPC-1、blaKPC-2、blaKPC-3、blaKPC-4、blaKPC-5、blaKPC-6、blaKPC-7、blaKPC-8、blaKPC-9、blaKPC-10、blaKPC-11、blaKPC-12、blaKPC-13、blaKPC-14、blaKPC-15、blaKPC-16、blaKPC-17、blaKPC-18、blaKPC-19、blaKPC-20、blaKPC-21、blaKPC-22、blaKPC-23、blaKPC-24、blaKPC-25、blaKPC-26、blaKPC-27、blaKPC-28、blaKPC-29、blaKPC-30、blaKPC-31、blaKPC-32、blaKPC-33、blaKPC-34、blaKPC-35、blaKPC-36、blaKPC-37、blaKPC-38、blaKPC-39、...

【专利技术属性】
技术研发人员：胡秀梅，王前，郑磊，芮勇宇，颜晓慧，杨彪，
申请(专利权)人：南方医科大学南方医院，
类型：发明
国别省市：广东;44