链置换型DNA聚合酶诱导等温循环扩增反应检测清真食品中猪源性禁忌物制造技术

本发明专利技术公开了一种应用链置换型DNA聚合酶诱导等温循环扩增反应检测清真食品中猪源性禁忌物的方法，属于食品安全检测技术领域。本发明专利技术通过多重序列对比确定了猪肉的检测靶核酸，设计了特异性的分子信标探针和引物，以肉类基因组DNA为模板，建立实时荧光链置换型DNA聚合酶诱导等温循环扩增反应体系，进行等温核酸扩增，并且验证了方法的特异性、灵敏度和检出限，还通过实际样品的检测确定了本发明专利技术建立的方法具有实际可行性。

【技术实现步骤摘要】
链置换型DNA聚合酶诱导等温循环扩增反应检测清真食品中猪源性禁忌物
本专利技术涉及一种链置换型DNA聚合酶诱导等温循环扩增反应检测清真食品中猪源性禁忌物的方法，属于食品安全检测

技术介绍
目前肉类鉴别形成了以蛋白质检测和以核酸检测为基础的两大主要检测体系。以蛋白质检测为基础的肉类本质鉴别技术包括免疫分析技术、蛋白质组学技术。在不同的前提条件下，各种方法有着自己的优点和局限性，但缺乏灵敏度高、特异性强、耗时短、费用低、操作简单等特点又能满足基本检验要求的方法。以核酸检测为基础的肉类掺假鉴别技术是基于DNA序列特异性的分子生物技术，以动物种属间遗传信息差异作为物种鉴别检测靶标的核酸检测方法如今被广泛应用。与蛋白质检测方法相比，DNA的热稳定性及酸碱稳定性均优于蛋白质，因此在加工后肉类的鉴别检测中具有明显优势，而核酸检测方法的高灵敏度和特异性也是蛋白检测方法无法比拟的。DNA探针杂交是最早用于食品中肉类成分鉴别的核酸检测方法。实时荧光定量PCR需要通过反复的热循环扩增，耗时较多；而环介导等温扩增法(Loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)的引物容易产生二聚体，而且复杂的反应体系容易产生假阳性，其在应用范围上受到了限制。因此，目前缺乏能够同时快速定量检测清真食品中肉类掺假的方法。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术提供了一种快速检测食品中猪源性成分的方法。该方法是以含有与猪肉基因组序列互补的特异性分子信标为模板，配制链置换型DNA聚合酶诱导等温循环扩增反应(Strand-displacementDNApolymeraseinducesisothermalcircularamplificationreaction，SDPICA)体系，置于酶标仪中，在特异性探针和循环引物的作用下进行恒温扩增，根据扩增曲线及荧光相对强度实现对猪肉的定性和(或)定量检测。具体地说，本专利技术方法通过多重序列对比确定了针对猪肉的检测靶核酸序列，并设计了特异性的分子信标探针(特异性探针)和引物(循环引物)，以猪肉DNA为模板，建立了实时荧光SDPICA检测体系，进行等温核酸扩增，根据扩增后的样品荧光强度验证SDPICA方法的特异性，根据扩增曲线测定实时荧光定量SDPICA方法的灵敏度和检出限，确定了本专利技术所建立的方法具有实际可行性。本方法利用解链引物和BstDNA聚合酶可在恒温条件对目标双链DNA进行边解旋边扩增，释放出后续反应的目标单链DNA，目标链与分子信标探针的特定部位互补配对，分子信标探针被打开由环状结构变成直链结构，荧光基团与淬灭基团随即分开，产生荧光信号。此外，该方法利用循环引物和Klenow酶与分子信标探针特定部分互补配对形成双链DNA并释放出目标单链DNA进入下一轮循环扩增，从而实现高灵敏度检测。本专利技术中所述的猪肉是指可检测出DNA序列的猪肉，其可以是猪身上任何部位的猪肉，比如可以是生鲜肉、里脊肉、后退肉、五花肉、奶脯肉等。上述方法中，所述分子信标探针的核苷酸序列(5’-3’)由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三部分依次组成，Ⅰ与Ⅲ互补配对。Ⅰ为TCTTGATCTCC、TCTTGCATCAG等；Ⅲ为GGAGATCAAGA、CTGATGCAAGA等；Ⅱ为与猪肉特异性基因组序列互补配对的探针环序列。所述分子信标探针的序列两端修饰有荧光基团与淬灭基团。荧光基团与淬灭基团为本领域常用的基团，比如用FAM荧光素修饰于序列的5’端，Dabcyl淬灭基团修饰于序列的3’端。所述含有猪肉目标序列的DNA是指含有检测靶核酸片段的核苷酸序列，其为猪肉的基因组DNA，并且它是依据线粒体Cytb基因设计。所述与目标序列互补配对的肉类探针环序列为(5’-3’)CCTCAATGGTATGCCACAAC、TTACACACATTTGTCGAGACGT等。所述循环引物为本领域技术人员熟知的能维持SDPICA循环反应的循环引物，比如可以是TCTTGATC、TCTTGCAT等。所述解链引物为本领域技术人员熟知的可以与目标链特异性结合的引物，比如可以是ATGAAAGAGGCAAATAGATTTTCG、ATTTACGTCTCGACAAATGTGTGTA等。所述SDPICA反应体系中Mg2+浓度为4～10mmol/L，甜菜碱浓度为0.8～1.5mol/L，dNTPs的浓度为1.2～2mmol/L，解链引物浓度为0.1～0.5μmol/L，Klenow聚合酶浓度为1～4U，分子信标探针浓度为0.1～0.5μmol/L，循环引物浓度为0.5～1μmol/L，BstDNA聚合酶为12～18U。所述酶标仪进行实时荧光SDPICA扩增的终点信号检测，激发波长为496nm、发射波长为521nm，底部检测，增益100，延迟100msec，检测高度7mm。所述方法的扩增时间为10～30min，扩增温度为37～38℃。此外，该方法还包括预先测定荧光信号强度与反应时间的关系，从而建立猪肉浓度与荧光信号强度之间的回归曲线关系；检测待测样品时，提取基因组DNA，进行SDPICA反应，检测荧光信号强度，代入回归曲线即可获知待测样品中猪肉的浓度。所述基因组DNA的提取方法为本领域常规提取方法，比如可以是试剂盒法、传统DNA抽提法(酚-氯仿法)、浓盐法、CTAB法、SDS法、热裂解法；优选试剂盒法。本专利技术与现有的技术相比，其显著优点在于：本专利技术方法基于实时荧光SDPICA反应，原理简单易懂，操作简单且可实时监控，对反应条件的要求不高。特异性探针以及两种特异性引物的选择性提高了检测方法对靶向目标物的特异性识别能力。本专利技术方法克服了传统PCR反应需要通过反复热循环扩增的缺点，避免了反复升降温的耗时过程，可实现恒温条件下的连续快速扩增，具有操作简单、快速、特异性强的特点。通过链置换型DNA聚合酶诱导等温循环扩增反应实现核酸扩增，靶向目标物含量较低时同样能实现检测，提高了本方法灵敏度，降低了检出限。附图说明图1：链置换型DNA聚合酶诱导等温循环扩增反应(SDPICA)检测原理图。图2：猪源性成分检测体系的特异性验证图；其中(a)为猪源性成分检测体系在检测不同肉类时荧光强度随时间的变化曲线、(b)为猪源性成分检测体系在检测不同肉类时20min的荧光强度对比图。图3：本专利技术方法的检测灵敏度考察图。图4：方法的检出限的考察图。具体实施方案结合实例对本专利技术做进一步描述：如图1所示，为SDPICA扩增原理示意图。从猪肉制品中提取所得的基因组DNA在BstDNA聚合酶和特异性解链引物的作用下，释放出靶核苷酸片段，SDPICA反应通过靶核酸片段与分子信标环序列的杂交打开分子信标探针的茎环结构，并在引物和DNA聚合酶的作用下形成MB-cDNA结构，保留已打开的分子信标探针信号，cDNA形成过程中释放靶核酸片段触发下一个循环，通过扩增实现信号的逐级放大，达到灵敏检测的目的。实施例1：1、猪肉制品基因组DNA提取(改良氯化钠法)称取0.5g猪肉生鲜肉，将样品置于匀浆机上混匀，放于研钵中，加入1mLTE缓冲液(10mMTris，1mMEDTA，pH8.0)；将匀浆液分装于不同的50mL离心管备用；将样品匀浆液溶解于8mL的lysis缓冲液(10mMTris-HCl，pH8.0；2mMED本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种链置换型DNA聚合酶诱导等温循环扩增反应检测猪肉成分的方法，其特征在于：该方法是以含有与猪肉目标序列的DNA互补的特异性分子信标为模板，配制链置换型DNA聚合酶诱导等温循环扩增反应体系，置于酶标仪中，在分子信标探针和循环引物的作用下进行恒温扩增，根据扩增曲线及荧光相对强度实现对猪肉的定性和/或定量检测。

【技术特征摘要】
1.一种链置换型DNA聚合酶诱导等温循环扩增反应检测猪肉成分的方法，其特征在于：该方法是以含有与猪肉目标序列的DNA互补的特异性分子信标为模板，配制链置换型DNA聚合酶诱导等温循环扩增反应体系，置于酶标仪中，在分子信标探针和循环引物的作用下进行恒温扩增，根据扩增曲线及荧光相对强度实现对猪肉的定性和/或定量检测。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：分子信标探针的核苷酸序列(5’-3’)由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三部分依次组成，Ⅰ与Ⅲ互补配对，Ⅱ为与肉类特异性基因组序列互补配对的探针环序列。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：Ⅰ与Ⅲ互补配对，Ⅰ为TCTTGATCTCC、TCTTGCATCAG；Ⅲ为GGAGATCAAGA、CTGATGCAAGA。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述分子信标探针的序列两端修饰有荧光基团与淬灭基团。5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：该方法利用...

【专利技术属性】
技术研发人员：沈晓芳，李晶，庞月红，严秀平，冯永巍，罗文涛，
申请(专利权)人：江南大学，无锡市食品安全检验检测中心，
类型：发明
国别省市：江苏,32