一种单子叶植物miRNA高效过表达载体的构建方法技术

本发明专利技术属于生物技术领域，公开了一种单子叶植物miRNA高效过表达载体的构建方法,包括以下步骤：S1,针对目标miRNA,制备与之对应的连接序列；S2,将S1所述连接序列克隆至克隆载体，以获得启动子‑连接序列‑终止子结构；S3，将用于过表达目标miRNA的茎环结构,导入到S2所述启动子‑连接序列‑终止子结构，以使其具有至少两所述茎环结构；S4，通过双酶切的方式将S3所得的启动子‑连接序列‑终止子结构克隆至双元载体。本发明专利技术连接效率高，操作简便易行，并可避免引入不必要的转基因成分，利于单子叶植物miRNA的功能研究，更有利于后续转基因植株的表型观察和结果解释。

Construction of a highly efficient Over-expression Vector of microRNAs in monocotyledons

The invention belongs to the field of biotechnology, and discloses a method for constructing an efficient Over-expression Vector of microRNAs in monocotyledon plants, including the following steps: S1, preparation of the corresponding connecting sequence for the target microNA; S2, cloning the connecting sequence of S1 into the cloning vector to obtain the promoter-connecting sequence-terminator structure; S3, introducing the stem-ring structure for over-expressing the target microNA into the cloning vector; The promoter connection sequence terminator structure of S2 is to have at least two stem ring structures; and the promoter connection sequence terminator structure of S3 is cloned into a binary vector by double digestion in S4. The invention has the advantages of high connection efficiency, simple operation, avoiding introducing unnecessary genetically modified components, facilitating the functional study of microRNAs in monocotyledons, and facilitating the phenotypic observation and result interpretation of subsequent genetically modified plants.

【技术实现步骤摘要】
一种单子叶植物miRNA高效过表达载体的构建方法
本专利技术涉及生物
，具体涉及一种单子叶植物miRNA高效过表达载体的构建方法，可用于单子叶植物miRNA功能的研究。
技术介绍
植物microRNA(miRNA)是一类长度约为20～24nt的內源性非编码小RNA(smallnon-codingRNA)，可与Argonaute(AGO)蛋白等结合形成RISC复合体(RNA-inducedsilencingcomplex)，通过直接切割靶基因的mRNA或抑制靶基因的翻译，以及通过切割来源于PHAS位点的转录本产生的大量phasiRNA间接作用于靶基因mRNA，实现对靶基因表达的抑制，进而影响植物生长发育过程，主要包括根的形成、茎和叶的发育、花器官的形成、果实的发育等以及生物和非生物胁迫的响应。植物miRNA基因的过表达是研究其功能的重要策略之一。目前常用的miRNA过表达方法是将目的miRNA的前体序列克隆到特定启动子驱动的双元载体后再转化目的植物，进而研究miRNA的功能，该方法常用的35S启动子在单子叶植物中表达较弱，对单子叶植物限制较大，部分环节操作难度较大。上述方法还常因目的miRNA表达量的不足而出现过表达植株表型不明显、单酶切连接效率低、容易引入不必要的转基因成分等不足。因此有必要对以上不足加以改进。
技术实现思路
为克服传统植物miRNA过表达方法存在的目的miRNA表达量的不足而出现过表达植株表型不明显的问题，专利技术人发现玉米Ubi启动子在单子叶植物组织中高效表达，在双子叶植物中则较弱，基于此提出了一种单子叶植物miRNA高效过表达载体的构建方法，其包括以下步骤：S1,针对目标miRNA,制备与之对应的连接序列；S2,将S1所述连接序列克隆至克隆载体，以获得启动子-连接序列-终止子结构；S3，将用于过表达目标miRNA的茎环结构,导入到S2所述启动子-连接序列-终止子结构，以使其具有至少两所述茎环结构；S4，通过双酶切的方式将S3所得的启动子-连接序列-终止子结构克隆至双元载体。优选的,在所述启动子-连接序列-终止子结构中，启动子包括Ubi启动子，终止子包括Nos终止子。优选的,在S2中，所述启动子-连接序列-终止子结构的两端均连接有酶切位点。优选的,在S2中，所述启动子-连接序列-终止子结构的两端分别连接有PacI酶切位点和MluI酶切位点。优选的,在S4中，所述启动子-连接序列-终止子结构克隆至双元载体后，其两端分别连接有PacI酶切位点和MluI酶切位点。优选的,在S3中，通过酶切和连接的方式将所述茎环结构到导入到所述启动子-连接序列-终止子结构中。优选的，在S2中，所述克隆载体包括pOT2-polycis-UN；在S4中，所述双元载体包括pCAMBIA1390-PM或pFGC5941-PM。优选的，双酶切所用内切酶为限制性内切酶，并包括PacI内切酶或MluI内切酶。本专利技术通过双酶切的方式将启动子-twohitmiRNA-终止子这一结构由中间载体克隆到双元载体以用于植物的转化，其中twohitmiRNA是指一段可同时表达两个包含目标miRNA茎环结构的序列，连接效率高，操作简便易行，并可避免引入不必要的转基因成分，利于单子叶植物miRNA的功能研究，更有利于后续转基因植株的表型观察和结果解释。附图说明下面结合附图和具体实施例对本专利技术作进一步详细说明。图1.克隆载体pOT2-polycis-UN的构建流程图。图2克隆载体pOT2-polycis-UN图谱。图3双元载体pCAMBIA1390-PM的构建流程图。图4双元载体pFGC5941-PM的构建流程图。图5植物转化用双元载体pCAMBIA1390-PM图谱。图6植物转化用双元载体pFGC5941-PM图谱。图7单子叶植物miRNA过表达载体的构建流程。图8双元载体pCAMBIA1390-two-hitOsamiR444.1、pCAMBIA1390-two-hitOsamiR444.3和pCAMBIA1390-two-hitOsamiR529a的酶切鉴定结果。图9pCAMBIA1390-two-hitOsamiR444.1的two-hitmiRNA过表达结构测序比对结果。图10pCAMBIA1390-two-hitOsamiR444.3的two-hitmiRNA过表达结构测序比对结果。图11pCAMBIA1390-two-hitOsamiR529a的two-hitmiRNA过表达结构测序比对结果。图12水稻miR444.1、miR444.3和miR529a在野生型植株(WT)以及T0代转基因单株中的表达量。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术进行进一步的描述：作为一种示例，本示例用于单子叶植物的miRNA高效过表达载体的构建方法，包括如下步骤：(1)载体的准备1.1、克隆载体pOT2-polycis-UN：参照图1所示流程，构建单子叶植物高效过表达所需中间载体pOT2-polycis-UN，导入PacI-Ubi启动子以及Nos终止子-MluI这一结构，构建成功的pOT2-polycis-UN的图谱如图2所示。构建所需引物的序列为：SmaI-PacI-Ubi-F(TCCCCCGGGTTAATTAAGCATGCCTGCAGTGCAGTGCAGC)(SEQIDNo.2)/HindIII-Ubi-R(CCCAAGCTTGAACTACCGGGCCCTAACCATGG)(SEQIDN0.3)；EcoRI-NOS-F(TCGGATCCCTGCTAGAATTCGATCGTTCAAACATTTGGCAATAAAG)(SeqIDNo.4)/SpeI-MluI-Nos-R(GGACTAGTCGACGCGTGATCTAGTAACATAGATGACACCG)(SEQIDNo.5)。上述引物由Invitrogen公司合成，PCR采用ThermoPHUSION高保真酶及其推荐的反应体系和程序；内切酶和连接酶购自NEB公司，采用其推荐的酶切和连接体系进行相关反应。改造后的克隆载体pOT2-polycis-UN两酶切位点PacI/MluI间的序列信息(包括酶切位点)如SEQIDNo.1所示。1.2、植物转化用双元载体pCAMBIA1390-PM和pFGC5941-PM：参照图3的流程，通过酶切连接的方法替换pCAMBIA1390-OsNLSCas9载体中的Ubi-OsNLSCas9结构，保留PacI和MluI酶切位点及两酶切位点间的序列SEQIDNo.6以构建pCAMBIA1390-PM双元载体。参照图4所示的流程，删除多余元件并将包含PacI和MluI酶切位点的序列SEQIDNo.6导入pFGC5941以构建pFGC5941-PM。改造后的pCAMBIA1390-PM以及pFGC5941-PM载体图谱如图5和图6所示，两个载体分别含有潮霉素和除草剂Basta抗性基因，可分别用于相关作物的转化。构建所需内切酶和连接酶购自NEB公司，采用其推荐的酶切和连接体系进行相关反应。(2)基于Ubi启动子的单子叶植物miRNA过表达载体的构建(图7)2.1、确定目标miRNA并列出其成熟序列以及互补链序列。如：成熟miRNA1为nnnnnnnnnnnnnnnnn本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种单子叶植物miRNA高效过表达载体的构建方法,其特征在于,包括以下步骤：S1,针对目标miRNA,制备与之对应的连接序列；S2,将S1所述连接序列克隆至克隆载体，以获得启动子‑连接序列‑终止子结构；S3，将用于过表达目标miRNA的茎环结构,导入到S2所述启动子‑连接序列‑终止子结构，以使其具有至少两所述茎环结构；S4，通过双酶切的方式将S3所得的启动子‑连接序列‑终止子结构克隆至双元载体。

【技术特征摘要】
1.一种单子叶植物miRNA高效过表达载体的构建方法,其特征在于,包括以下步骤：S1,针对目标miRNA,制备与之对应的连接序列；S2,将S1所述连接序列克隆至克隆载体，以获得启动子-连接序列-终止子结构；S3，将用于过表达目标miRNA的茎环结构,导入到S2所述启动子-连接序列-终止子结构，以使其具有至少两所述茎环结构；S4，通过双酶切的方式将S3所得的启动子-连接序列-终止子结构克隆至双元载体。2.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,在所述启动子-连接序列-终止子结构中，启动子包括Ubi启动子，终止子包括Nos终止子。3.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,在S2中，所述启动子-连接序列-终止子结构的两端均连接有酶切位点。4.根据权利要求1所述的构建方法,其特征在于,在...

【专利技术属性】
技术研发人员：唐贵良，杨晓玉，李琳，罗淋淋，刘琳，罗光宇，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：广东,44