一种基于II型内含子的基因编辑方法技术

本发明专利技术公开了一种基于II型内含子的基因组编辑方法，包括步骤如下：脱水四环素诱导的II型内含子表达载体pSY11的构建及诱导表达；内含子编码蛋白反转录结构域关键活性位点的筛选和定点突变；II型内含子基因编辑载体的设计及构建。本发明专利技术能实现任意基因编辑，具有无疤、高效、靶向精确的特点。

A Gene Editing Method Based on Type II Intron

The present invention discloses a genome editing method based on type II intron, which includes the following steps: construction and induction of dehydrated tetracycline-induced type II intron expression vector pSY11; screening and site mutation of key active sites in intron coding protein reverse transcription domain; design and construction of type II intron gene editing vector. The invention can realize any gene editing, and has the characteristics of scarless, high efficiency and accurate targeting.

【技术实现步骤摘要】
一种基于II型内含子的基因编辑方法
本专利技术涉及分子生物学领域，具体涉及一种基于II型内含子的基因编辑方法。
技术介绍
II型内含子（groupIIintron）是一类反转录转座子，主要存在于细菌以及部分高等生物的细胞器中。II型内含子是由具有催化功能的内含子RNA（即核酶）和具有反转录酶活性的内含子编码蛋白（IEP）两部分组成，可通过“归巢”机制高频插入到特定DNA靶位点。其中，内含子RNA通过碱基互补配对原则识别并切割DNA靶位点，内含子编码蛋白则通过稳定活性RNA的结构而辅助内含子RNA的剪接和整合。内含子编码蛋白还具有反转录酶活性，能够以插入的内含子RNA为模板，反转录合成互补DNA，从而将内含子RNA整合到DNA靶位点，其具体过程如图1所示，通过这种机制，II型内含子可以高效插入到DNA靶位点。由于II型内含子对DNA靶位点的识别主要是通过内含子RNA的碱基配对来实现的，而且II型内含子在DNA靶位点的插入具有高度专一性和高效性，因此可以利用II型内含子的这些特性，设计基因打靶载体，通过修饰内含子RNA的碱基序列实现靶向中断特定基因的表达。利用II型内含子“归巢”的特性，目前已建立起高效基因打靶技术—Targetron技术。该技术具有打靶精度高、易操作、成本低廉的特点，在革兰氏阴性菌（如：大肠杆菌）和革兰氏阳性菌（如：金黄色葡萄球菌）的遗传改造中均获得广泛应用。而且，由于Targetron的高效打靶效率，该技术尤其适用于难改造的革兰氏阳性厚壁梭菌，如：肉毒梭菌、艰难梭菌、丙酮丁醇梭菌，解纤维梭菌等，该技术在梭菌中也称为Clostron技术。然而，Targetron技术只能实现了基因的“有疤”失活，不能实现“无痕”基因敲除和敲入。这是由于II型内含子的IEP蛋白具有反转录活性，在形成双链断裂的同时，以内含子RNA为模板合成cDNA，并插入到DNA断裂处，从而以在DNA靶位点插入一段内含子序列的方式实现靶基因的“有疤”失活。基因组编辑的本质是在DNA靶位点引入双链DNA断裂，激发DNA修复机制，然后利用宿主的损伤修复机制实现目的基因的敲除、敲入、突变等功能。因此，如何在靶位点引入双链DNA断裂，造成DNA损伤，是实现高效基因组编辑的前提。野生型II型内含子在识别、切割DNA靶位点之后，利用IEP蛋白的反转录酶活性将内含子RNA插入到DNA内部，实现内含子在染色体上的“归巢”，因此会在靶位点留下“疤痕”（图1）。要利用II型内含子技术实现基因的定点“无痕”敲除、敲入、突变等多项功能，必须对II型内含子的功能元件进行改造，在保留内含子识别切割DNA特性的同时，阻断其“归巢”途径，在靶位点获得DNA双链缺口，然后通过非同源末端连接或同源重组机制进行DNA损伤修复，最终实现目标基因的“无痕”编辑。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服上述缺点而提供的一种能实现任意基因编辑，具有无疤、高效、靶向精确的基于II型内含子的基因编辑方法。本专利技术的技术方案是：一种基于II型内含子的基因组编辑方法，包括步骤如下：（1）脱水四环素诱导的II型内含子表达载体pSY11的构建及诱导表达；（2）内含子编码蛋白反转录结构域关键活性位点的筛选和定点突变；（3）II型内含子基因编辑载体的设计及构建。上述的一种基于II型内含子的基因组编辑方法，其中脱水四环素诱导的II型内含子表达载体pSY11的构建及诱导表达方法为：以来源于质粒pGusA2-2tetO1的脱水四环素操纵子为模板，利用引物tetR-U（tcgacggatccccgggaactcgacatcttggttaccg）和tetR-D（gatagagtcctaggccaggtcgatcgattatattgataaaaataataatagtgg）及引物Pcm-tetO1-U（caatataatcgatcgacctggcctaggactctatcattgatagagtttgaaactctatc）和Pcm-tetO1-D（gataattatctcgagcatatgaactaacctcctaaactagttacc），分别扩增阻遏蛋白和脱水四环素诱导型启动子，然后利用重叠延伸PCR将阻遏蛋白和脱水四环素诱导型启动子组装为脱水四环素操纵子。上述的一种基于II型内含子的基因组编辑方法，其中内含子编码蛋白反转录结构域关键活性位点的筛选和定点突变方法为：a）利用XmaI和XhoI双酶切，将脱水四环素操纵子与来源于pSY6载体的乳酸乳球菌II型内含子（Ll.ltrB）的内含子RNA与内含子编码蛋白（LtrA,GenBank:AKU48235.1）连接，构建脱水四环素诱导的pSY11基因编辑载体。（见附图3及序列文件）；b）利用NCBI数据库及同源序列比对方法，以内含子编码蛋白（LtrA,GenBank:AKU48235.1）为模板，对内含子编码蛋白进行序列分析及结构模拟，筛选影响II型内含子编码蛋白反转录功能的关键氨基酸位点，筛选获得的活性位点包括：D160、I161、K162、G163、C164、F165、Q213、G214、Y306、D308、D309、L357、G358；c）对筛选到的关键氨基酸位点分别进行定点突变，突变位点包括13个单突变：D160A、I161A、K162A、G163A、C164A、F165A、Q213A、G214A、Y306A、D308A、D309A、L357A、G358A，2个双突变：D308A’D309A、D308K’D309K。上述的一种基于II型内含子的基因组编辑方法，其中II型内含子基因编辑载体的设计及构建方法为：将上述突变型内含子编码蛋白分别取代pSY11基因编辑载体上的野生型内含子编码蛋白，构建无反转录活性的基因编辑载体pSY11-Mx，Mx代表含有上述不同突变位点的载体。例如：pSY11-D160A，表示pSY11载体的内含子编码蛋白含有一个D160A点突变。上述的一种基于II型内含子的基因组编辑方法，其中：所述II型内含子基因编辑载体，该载体主要应用于微生物细菌领域的基因工程改造。本专利技术与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知：本专利技术利用II型内含子的“归巢”依赖于IEP蛋白的反转录功能。IEP蛋白是II型内含子的关键功能元件，属于多功能酶，具有反转录酶、成熟酶（促进RNA剪接及稳定RNA结构）和核酸内切酶（协助内含子迁移）等多种活性，在II型内含子“归巢”的各步中起到重要作用。从结构上看，IEP蛋白包括四个相对独立的功能区域：反转录功能域、DNA结合域、核酸内切酶区域和未知功能区域，其中反转录酶活性主要由反转录功能域行使，因此，IEP蛋白反转录功能的失活在理论上不会影响其他结构域的活性，即：可以获得新型的IEP蛋白，仅失去反转录酶活性，仍保留辅助RNA折叠、成熟、靶位点识别、切割等其他功能。利用该新型IEP蛋白就能阻断II型内含子固有的“归巢”途径，在不留下插入序列“疤痕”的条件下获得DNA双链断裂，最终实现基因的定点、“无痕”敲除或敲入（图2）。本专利技术通过对乳酸乳球菌（Lactococcuslactis）II型内含子编码蛋白（LtrA）的设计及改造，失活了内含子编码蛋白的反转录活性，阻断了其“归巢”功能，从而可以在靶位点引入DN本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于II型内含子的基因组编辑方法，包括步骤如下：（1）脱水四环素诱导的II型内含子表达载体pSY11的构建及诱导表达；（2）内含子编码蛋白反转录结构域关键活性位点的筛选和定点突变；（3）II型内含子基因编辑载体的设计及构建。

【技术特征摘要】
1.一种基于II型内含子的基因组编辑方法，包括步骤如下：（1）脱水四环素诱导的II型内含子表达载体pSY11的构建及诱导表达；（2）内含子编码蛋白反转录结构域关键活性位点的筛选和定点突变；（3）II型内含子基因编辑载体的设计及构建。2.如权利要求1所述的一种基于II型内含子的基因组编辑方法，其中脱水四环素诱导的II型内含子表达载体pSY11的构建及诱导表达方法为：以来源于质粒pGusA2-2tetO1的脱水四环素操纵子为模板，利用引物tetR-U（tcgacggatccccgggaactcgacatcttggttaccg）和tetR-D（gatagagtcctaggccaggtcgatcgattatattgataaaaataataatagtgg）及引物Pcm-tetO1-U（caatataatcgatcgacctggcctaggactctatcattgatagagtttgaaactctatc）和Pcm-tetO1-D（gataattatctcgagcatatgaactaacctcctaaactagttacc），分别扩增阻遏蛋白和脱水四环素诱导型启动子，然后利用重叠延伸PCR将阻遏蛋白和脱水四环素诱导型启动子组装为脱水四环素操纵子。3.如权利要求1所述的一种基于II型内含子的基因组编辑方法，其中内含子编码蛋白反转录结构域关键活性位点的筛选和定点突变方法为：a）利用XmaI和XhoI双酶切，将脱水四环素操纵子与来源于pSY6载体的乳酸乳球菌II型内含子（Ll.ltrB）的内含子RNA与...

【专利技术属性】
技术研发人员：崔古贞，陈峥宏，陈相好，洪伟，张峥嵘，綦廷娜，刘芳，
申请(专利权)人：贵州医科大学，
类型：发明
国别省市：贵州,52