硫化叶菌蛋白复合物的表达载体的构建及表达纯化方法技术

本发明专利技术公开了一种硫化叶菌蛋白复合物的表达载体的构建及表达纯化方法。所述的构建方法利用大肠杆菌质粒给硫化叶菌目标蛋白复合物的亚基基因带上10×His‑StrepⅡ标签序列，然后将带标签的目的基因连接到pSeSD中，得到pSeSD表达载体，再将pSeSD表达载体转化到硫化叶菌中，阿拉伯糖诱导目的基因表达，通过该亚基与蛋白复合物其他亚基间的相互作用，利用目的蛋白上的His标签纯化整个蛋白复合物。本发明专利技术方法使硫化叶菌复合物的表达纯化更加简单，且易于操作，可以用于硫化叶菌复合物的研究工作。

【技术实现步骤摘要】
硫化叶菌蛋白复合物的表达载体的构建及表达纯化方法
本专利技术属于基因工程
，涉及一种硫化叶菌蛋白复合物的表达载体的构建及表达纯化方法。
技术介绍
随着基因测序技术的发展，古细菌作为区别于真细菌和真核生物的独立的域逐渐被人们接受。古细菌兼有真核生物和原核生物的特性以及部分古细菌独特的性质，常作为真核生物的简化研究模型。簇状有规律的间隔的短回文序列(CRISPR)是一些存在于古细菌和真细菌基因组中的特殊序列。CRISPR序列和相关蛋白-Cas蛋白一起构成了原核生物的获得性免疫系统，用于抵抗外来遗传物质的入侵。JingZhang等利用给蛋白亚基添加标签的方法研究了硫矿硫化叶菌P2的CMR复合物(SpringerNewYork,2015)和CSM复合物(MolecularCell,2013)，但其使用的基于病毒构建的质粒pSVA9除了名称外没有公布任何信息，也难以构建类似的质粒，因此该方法被局限在硫矿硫化叶菌的研究中，而许多硫化叶菌如冰岛硫化叶菌的研究还停留在基因组学和细胞的层面上。硫化叶菌中的移动基因元件包括质粒和病毒，都曾被用于载体构建，但可操作性和稳定性都较差。pSeSD质粒是由华中农业大学佘新群教授团队构建的，被用于基因组学和遗传学的研究，其带有启动子araS衍生的启动子ParaS-SD，能够引导高效的基因表达。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种硫化叶菌蛋白复合物的表达载体的构建及表达纯化方法，该方法基于大肠杆菌-硫化叶菌穿梭质粒pSeSD的重组质粒，利用硫化叶菌蛋白复合物亚基的表达来纯化整个蛋白复合物。实现本专利技术目的的技术解决方案如下：硫化叶菌蛋白复合物的表达载体的构建方法，具体步骤如下：步骤1，设计一段带有10×His-StrepⅡ标签序列的合成序列，序列上带有4个酶切位点，顺序是XhoⅠ-NdeⅠ-任意序列-SalⅠ-10×His-StrepⅡ-NotⅠ，通过限制性内切酶XhoⅠ和NotⅠ将合成序列连接到质粒载体pBluescriptⅡKS(-)(简称pKS)中，得到pKS-10×His-StrepⅡ载体；步骤2，设计PCR引物，分别带有限制性内切酶酶切位点NdeⅠ和SalⅠ，通过硫化叶菌基因组的PCR反应得到目的蛋白复合物亚基基因的PCR产物，用限制性内切酶NdeⅠ和SalⅠ分别酶切该PCR产物和pKS-10×His-StrepⅡ质粒，通过T4连接酶连接，得到pKS-目的基因-10×His-StrepⅡ载体；步骤3，用限制性内切酶NdeⅠ和NotⅠ分别酶切质粒pSeSD和pKS-目的基因-10×His-StrepⅡ载体，通过连接反应，得到pSeSD-目的基因-10×His-StrepⅡ载体。本专利技术还提供硫化叶菌蛋白复合物的表达纯化方法，具体步骤为：将pSeSD-目的基因-10×His-StrepⅡ载体转化到硫化叶菌中，通过阿拉伯糖诱导，表达出目的蛋白，目的蛋白在后续加工过程中折叠进蛋白复合物中，利用目的基因上的His或StrepⅡ标签，纯化得到目标蛋白复合物。优选地，所述的阿拉伯糖的浓度为0.2％(m/v)。本专利技术与现有技术相比，其优点在于：1、传统的给蛋白添加标签的方式是设计带有标签DNA序列的PCR引物，通过PCR反应，得到带有标签序列的目的基因。这种方法具有较大的不确定性，利用硫化叶菌基因组进行PCR反应时，标签序列容易发生错配，导致PCR结果出错。本方法通过酶切酶连反应构建载体，可以避免盲目地尝试。2、许多病毒载体如SSV1、SSV2虽然被用作表达载体，但操作难度大且不稳定。以lacS作为选择标记的硫化叶菌载体如pKL1、pKL2、pHZ2lacS要求培养基只能有极少量的乳糖加上无机氮源，在这样的培养基中所有的硫化叶菌种类都生长缓慢。本方法利用pSeSD载体来构建硫化叶菌的表达载体，使用尿嘧啶作为选择标记，对培养基的要求降低，降低了操作的难度。3、将通过蛋白亚基纯化整个蛋白复合物的方法从硫矿硫化叶菌P2中推广到整个硫化叶菌属中，并且改善了该方法的可操作性。附图说明图1为质粒pZFP001图谱，带有10×His+StrepⅡ标签序列的pKS质粒。图2为质粒pZFP002图谱，为pKS-cmr3-10×His-StrepⅡ质粒，cmr3显示为黄色。图3为cmr3的PCR结果，使用ThermoFisherDL2000DNAladder，证明通过得到了cmr3基因序列，后期测序也证明序列是正确的。图4为A)质粒pZFP001的单酶切和双酶切验证，证明带有标签序列的244bp的片段有连接到pKS质粒中；B)质粒pZFP002的双酶切验证，证明cmr3基因正确连接到pZFP001中。图5为质粒pZFP003图谱，为了能够显示各组件，标签序列的显示长度比实际长。图6为pZFP003的双酶切验证，箭头的位置是cmr3序列的片段，不太明显。证明带有标签序列的cmr3基因正确连接到pSeSD中。图7为带标签的Cmr3蛋白的WB结果，带标签的Cmr6蛋白是正对照。证明Cmr3和Cmr6蛋白及其带有的His标签在冰岛硫化叶菌中正确表达。图8为HisTrap柱纯化后蛋白的SDS-PAGE图。其中A11、A12、B6、B5、B4、B2、B1是从对应紫外吸收峰(A11～A12,B12～B1)上间断选取的样品，D7、D6为后出现的小峰对应的样品。对照表11可以找到Cmr复合物各亚基的位置，证明通过Cmr3亚基纯化得到了Cmr复合物。具体实施方式下面结合实施例和附图对本专利技术作进一步详述。本专利技术的保护内容不局限于以下实施例。在不背离专利技术构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化都包括在本专利技术中。实施本专利技术的过程、条件、试剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本专利技术没有特别限制内容。1、菌株和质粒来源表1使用的菌株和质粒2、关于大肠杆菌和冰岛硫化叶菌菌种的保存：将处于对数期的菌液保存于含15％甘油未调pH的培养基中，分装于无菌的2mL离心管中，于-80℃冻存。2.1培养基母液的配制冰岛硫化叶菌的液体培养基MTSV可用于野生型菌株REY15A的培养，而培养基MTSVU则额外添加尿嘧啶，使尿嘧啶缺陷型菌株E233S可以生长。表21000×微量元素表350×G溶液表41000×钙镁溶液表51000×维生素混合溶液表6其他母液的配制2.2液体培养基表7MT培养基实验中用到LB培养基：每升液体培养基含胰蛋白胨(Tryptone)10g，酵母提取物(YeastExtract)5g，氯化钠(NaCl)10g；固体培养基在液体LB的基础上加入1.5％(m/v)的琼脂。冰岛硫化叶菌有关培养基的配制，参考了Brock等报导的硫化叶菌培养基和JingZhang等使用的硫矿硫化叶菌培养基。2.3固体培养基表8冰岛硫化叶菌固体培养基底层平板母液向上述溶液中加入1000×微量元素和钙镁溶液(将原1000×溶液按照60×计算)，调pH至3.9，定容后高温湿热灭菌。配置1.6％(w/v)的Gelrite，高温湿热灭菌。将两种灭菌后的溶液冷却到80℃左右，加入1000×维生素和100×蔗糖，然后等体积混合均匀，倒平板。上层平板使用2×MTSV培养基(pH为3.9)，除1000×钙镁溶液按60×计算本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.硫化叶菌蛋白复合物的表达载体的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：步骤1，设计一段带有10×His‑StrepⅡ标签序列的合成序列，序列上带有4个酶切位点，顺序是XhoⅠ‑NdeⅠ‑任意序列‑SalⅠ‑10×His‑StrepⅡ‑NotⅠ，通过限制性内切酶XhoⅠ和NotⅠ将合成序列连接到质粒载体pBluescriptⅡKS(‑)中，得到pKS‑10×His‑StrepⅡ载体；步骤2，设计PCR引物，分别带有限制性内切酶酶切位点NdeⅠ和SalⅠ，通过硫化叶菌基因组的PCR反应得到目的蛋白复合物亚基基因的PCR产物，用限制性内切酶NdeⅠ和SalⅠ分别酶切该PCR产物和pKS‑10×His‑StrepⅡ质粒，通过T4连接酶连接，得到pKS‑目的基因‑10×His‑StrepⅡ载体；步骤3，用限制性内切酶NdeⅠ和NotⅠ分别酶切质粒pSeSD和pKS‑目的基因‑10×His‑StrepⅡ载体，通过连接反应，得到pSeSD‑目的基因‑10×His‑StrepⅡ载体。

【技术特征摘要】
1.硫化叶菌蛋白复合物的表达载体的构建方法，其特征在于，具体步骤如下：步骤1，设计一段带有10×His-StrepⅡ标签序列的合成序列，序列上带有4个酶切位点，顺序是XhoⅠ-NdeⅠ-任意序列-SalⅠ-10×His-StrepⅡ-NotⅠ，通过限制性内切酶XhoⅠ和NotⅠ将合成序列连接到质粒载体pBluescriptⅡKS(-)中，得到pKS-10×His-StrepⅡ载体；步骤2，设计PCR引物，分别带有限制性内切酶酶切位点NdeⅠ和SalⅠ，通过硫化叶菌基因组的PCR反应得到目的蛋白复合物亚基基因的PCR产物，用限制性内切酶NdeⅠ和SalⅠ分别酶切该PCR产物和pKS-10×His-StrepⅡ质粒，通过T4连接酶连接，得到...

【专利技术属性】
技术研发人员：周敏，祝发鹏，卢颖洪，路俊欣，
申请(专利权)人：南京理工大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32