α-红没药醇合成质粒及其构建方法与大肠杆菌工程菌株技术

本发明专利技术公开了α‑红没药醇合成质粒及其构建方法与大肠杆菌工程菌株，构建IPP和DMAPP合成质粒pS‑MVA以及α‑红没药醇合成质粒，再将两种质粒共同导入到大肠杆菌菌株E.coli DH5α。α‑红没药醇合成质粒是以pTrc99A载体为骨架质粒，组装有大肠杆菌基因ispA和一个不同来源的人工合成型α‑红没药醇合成酶基因或野生型α‑红没药醇合成酶基因；人工合成型α‑红没药醇合成酶基因选自AaBBS、LdBBS、MrBBS、ScBBS以及SsBBS中一种；野生型α‑红没药醇合成酶基因选自LdBBS、ScBBS以及MrBBS中一种。本发明专利技术利用生物方法合成了α‑红没药醇，产量高，活性高，绿色环保。

Synthetic plasmid of alpha red myrrh alcohol and its construction method and engineering strain of Escherichia coli

The invention discloses the synthetic plasmid of alpha red myrrh and its construction method and Escherichia coli engineering strain, and constructs IPP and DMAPP synthetic plasmids pS MVA and the synthesis plasmids of alpha red myrrh, and then co import the two plasmids into the Escherichia coli strain E.coli DH5 alpha. The recombinant plasmid of alpha red myrrh is a pTrc99A vector as the skeleton plasmid, which consists of the Escherichia coli gene ispA and a different source of synthetic alpha red myrrh synthetase gene or wild alpha red myrrh synthase gene. The synthetic alpha erythromyrrrrl synthase gene is selected from AaBBS, LdBBS, MrBBS, ScBBS. And one of SsBBS; the wild type of alpha myrrh synthetase gene is selected from LdBBS, ScBBS and MrBBS. The invention syntheses alpha - myrrh alcohol by biological method, and has high yield, high activity and environmental protection.

【技术实现步骤摘要】
α-红没药醇合成质粒及其构建方法与大肠杆菌工程菌株
本专利技术属于代谢工程领域，具体涉及一种α-红没药醇合成质粒及其构建方法与大肠杆菌工程菌株和应用。
技术介绍
α-红没药醇（bisabolol）又称甜没药醇，是自然界中存在的一种天然倍半萜醇。它有几种旋光异构体如下所示：他们分别在医药，食品和化妆品等行业发挥着重要的作用。(-)-α-红没药醇主要存在于菊科植物春黄菊花（Matricariarecutita）等植物中，具有抗菌、抗炎、抗微生物、抗消化等作用。它作为活性成分用于皮肤化妆品或抑制皮肤炎症，以保护和护理过敏性皮肤等。美洲本土草药甜舌草（Lippiadulcis）中含有的荷南度辛（hernandulcin）是一种天然的高效甜味剂，其的主链就是(+)-α-红没药醇。荷南度辛具有比蔗糖千倍以上的增甜能力，且不会像其它的合成甜味剂（如糖精、阿斯巴甜和三氯蔗糖）等对人体产生不好的影响。它可以作为理想的蔗糖的替代品为肥胖和糖尿病人群提供更好的甜品食物体验，而不产生高热量负担。因此，利用(+)-α-红没药醇合成荷南度辛，值得期待。此外，红没药醇还会散发出清淡令人愉快的香气，也是一种稳定性优良的定香剂，日益在香料香精化妆品的应用中受到重视。然而，α-红没药醇作为次级代谢产物，天然产量有限，以现行的生物质直接提取方式获取α-红没药醇还受制于生物体生长周期、环境、地域等诸多因素，且生产规模的扩张会危及生态和环境安全，甚至造成濒危植物消失的生态灾难。若采用化学合成的方式，α-红没药醇复杂手性化学结构，使得直接化学合成难度高，纯度低，生物活性差。大肠杆菌(Escherichiacoli)作为最为广泛的模式微生物，相较于植物细胞，甚至其它一些微生物，具有生长周期短、遗传背景清晰、遗传操作简单成熟和易于规模扩大化培养等优点，因此，利用合成生物构建大肠杆菌微细胞工厂可以实现以廉价的碳源和培养基生产具有高附加值和广泛用途的α-红没药醇，是一条可持续发展的替代途径。
技术实现思路
本专利技术目的是提供一种α-红没药醇合成质粒及其构建方法与大肠杆菌工程菌株和应用，本专利技术构建了一种α-红没药醇合成质粒并导入大肠杆菌中获得大肠杆菌工程菌株，在大肠杆菌工程菌株合成α-红没药醇，还通过合成生物学方法优化工程菌株提高α-红没药醇产量。为达到上述目的，本专利技术采用的技术方案是：一种α-红没药醇合成质粒，α-红没药醇合成质粒是以pTrc99A载体为骨架质粒，该骨架质粒上组装有大肠杆菌基因ispA和一个不同来源的人工合成型α-红没药醇合成酶基因或野生型α-红没药醇合成酶基因；所述人工合成型α-红没药醇合成酶基因选自人工合成型AaBBS基因、人工合成型LdBBS基因、人工合成型MrBBS基因、人工合成型ScBBS基因以及人工合成型SsBBS基因中的任意一种，核苷酸序列分别如序列表SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4以及SEQIDNo.5所示，相对应地，所述α-红没药醇合成质粒被分别命名为pT-IAa、pT-ILd、pT-IMr、pT-ISc以及pT-ISs；所述野生型α-红没药醇合成酶基因选自野生型LdBBS基因、野生型ScBBS基因以及野生型MrBBS基因中的任意一种，相对应的，所述α-红没药醇合成质粒被分别命名为pT-ILdWT、pT-IScWT和pT-IMrWT。当骨架质粒上组装有大肠杆菌基因ispA和一个不同来源的人工合成型α-红没药醇合成酶基因时，所述α-红没药醇合成质粒的构建方法，包括如下步骤：（1）ispA基因片段经PCR以大肠杆菌MG1655基因组DNA为模版扩增获取，扩增的上游引物ispA-EcoR-F的序列为5’-ACGAATTCATAAGGTAAAGGTATGGACTTTCCGCAGC-3’和下游引物ispA-BamH-R的序列为5’-TCGGATCCTAAGATCTTATTTATTACGCTGGATG-3’；扩增所得基因片段经过EcoRI和BamHI消化后插入到pTrc99A载体的EcoRI和BamHI两位点之间，获得质粒pT-ispA；（2）所述人工合成型α-红没药醇合成酶基因克隆在所述质粒pT-ispA的BamHI和SalI位点之间，即分别获得质粒pT-IMr、pT-ILd、pT-IAa、pT-ISc、pT-ISs。当骨架质粒上组装有大肠杆菌基因ispA和一个不同来源的野生型α-红没药醇合成酶基因时，所述α-红没药醇合成质粒的构建方法，包括如下步骤：（1）ispA基因片段经PCR以大肠杆菌MG1655基因组DNA为模版扩增获取，扩增的上游引物ispA-EcoR-F的序列为5’-ACGAATTCATAAGGTAAAGGTATGGACTTTCCGCAGC-3’和下游引物ispA-BamH-R的序列为5’-TCGGATCCTAAGATCTTATTTATTACGCTGGATG-3’；扩增所得基因片段经过EcoRI和BamHI消化后插入到pTrc99A载体的EcoRI和BamHI两位点之间，获得质粒pT-ispA；（2）所述野生型ScBBS基因通过PCR的方法从S.citricolor基因组DNA扩增获取，所述野生型LdBBS和野生型MrBBS基因从相应的cDNA中扩增获取；所用基因引物序列如下：上游引物ScBBSWT–F的序列为5’-GTGGATCCAAGGAGATATATCAAATGAACTCCCTCCTCCACGCCGCAGAG-3’；下游引物ScBBSWT-R的序列为5’-TAGCTCGAGAAGGCCCGTGCGTGTCATGGGTGGTAG-3’；上游引物LdBBSWT-F的序列为5’-AGTGGATCCAAGGAGATATATCAAATGAATTCCACATCCAGGAGATC-3’；下游引物LdBBSWT-R的序列为5’-TATCGTCGACTTATGGAAGAGGAATGGGTTC-3’；上游引物MrBBSWT-F的序列为5’-TGGATCCAAGGAGATATATCAAATGTCAACTTTATCAGTTTCTAC-3’；下游引物MrBBSWT–R的序列为5’-TAGAGTCGACTTAGACAATCATAGGGTGAACGAAG-3’；（3）将步骤（2）扩增所得的基因片段插入到质粒pT-ispA的BamHI和SalI位点之间，即分别获得质粒pT-ILdWT、pT-IMrWT和pT-IScWT。一种大肠杆菌工程菌株，是由下列方法构建得到的：（1）由粪肠球菌基因mvaES、肺炎链球菌基因mvaK1DK2以及大肠杆菌基因idi组成完整的IPP和DMAPP合成操纵子，将IPP和DMAPP合成操纵子克隆到pSTV28质粒的EcoRI和HindIII两个限制性内切酶位点之间，并受乳糖启动子lac的驱动，得到IPP和DMAPP合成质粒pS-MVA；（2）按照权利要求2或3所述的构建方法构建权利要求1所述的α-红没药醇合成质粒，所述α-红没药醇合成质粒选自pT-IAa、pT-ILd、pT-IMr、pT-ISc以及pT-ISs中的任意一种，或者所述α-红没药醇合成质粒选自pT-ILdWT、pT-IScWT以及pT-IMrWT中的任意一种；（3）将步骤（2）获得的α-红没药醇合成质粒与本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种α‑红没药醇合成质粒，其特征在于：所述α‑红没药醇合成质粒是以pTrc99A载体为骨架质粒，该骨架质粒上组装有大肠杆菌基因ispA和一个不同来源的人工合成型α‑红没药醇合成酶基因或野生型α‑红没药醇合成酶基因；所述人工合成型α‑红没药醇合成酶基因选自人工合成型AaBBS 基因、人工合成型LdBBS 基因、人工合成型MrBBS基因、人工合成型ScBBS基因以及人工合成型SsBBS基因中的任意一种，核苷酸序列分别如序列表SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4以及SEQ ID No.5所示，相对应的，所述α‑红没药醇合成质粒被分别命名为pT‑IAa、pT‑ILd、pT‑IMr、pT‑ISc以及pT‑ISs；所述野生型α‑红没药醇合成酶基因选自野生型LdBBS基因、野生型ScBBS基因以及野生型MrBBS基因中的任意一种，相对应地，所述α‑红没药醇合成质粒被分别命名为pT‑ILdWT、pT‑IScWT和pT‑IMrWT。

【技术特征摘要】
1.一种α-红没药醇合成质粒，其特征在于：所述α-红没药醇合成质粒是以pTrc99A载体为骨架质粒，该骨架质粒上组装有大肠杆菌基因ispA和一个不同来源的人工合成型α-红没药醇合成酶基因或野生型α-红没药醇合成酶基因；所述人工合成型α-红没药醇合成酶基因选自人工合成型AaBBS基因、人工合成型LdBBS基因、人工合成型MrBBS基因、人工合成型ScBBS基因以及人工合成型SsBBS基因中的任意一种，核苷酸序列分别如序列表SEQIDNo.1、SEQIDNo.2、SEQIDNo.3、SEQIDNo.4以及SEQIDNo.5所示，相对应的，所述α-红没药醇合成质粒被分别命名为pT-IAa、pT-ILd、pT-IMr、pT-ISc以及pT-ISs；所述野生型α-红没药醇合成酶基因选自野生型LdBBS基因、野生型ScBBS基因以及野生型MrBBS基因中的任意一种，相对应地，所述α-红没药醇合成质粒被分别命名为pT-ILdWT、pT-IScWT和pT-IMrWT。2.根据权利要求1所述α-红没药醇合成质粒的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）ispA基因片段经PCR以大肠杆菌MG1655基因组DNA为模版扩增获取，扩增的上游引物ispA-EcoR-F的序列为5’-ACGAATTCATAAGGTAAAGGTATGGACTTTCCGCAGC-3’和下游引物ispA-BamH-R的序列为5’-TCGGATCCTAAGATCTTATTTATTACGCTGGATG-3’；扩增所得基因片段经过EcoRI和BamHI消化后插入到pTrc99A载体的EcoRI和BamHI两位点之间，获得质粒pT-ispA；（2）所述人工合成型α-红没药醇合成酶基因克隆在所述质粒pT-ispA的BamHI和SalI位点之间，即分别获得质粒pT-IMr、pT-ILd、pT-IAa、pT-ISc、pT-ISs。3.根据权利要求1所述α-红没药醇合成质粒的构建方法，其特征在于：包括如下步骤：（1）ispA基因片段经PCR以大肠杆菌MG1655基因组DNA为模版扩增获取，扩增的上游引物ispA-EcoR-F的序列为5’-ACGAATTCATAAGGTAAAGGTATGGACTTTCCGCAGC-3’和下游引物ispA-BamH-R的序列为5’-TCGGATCCTAAGATCTTATTTATTACGCTGGATG-3’；扩增所得基因片段经过EcoRI和BamHI消化后插入到pTrc99...

【专利技术属性】
技术研发人员：王崇龙，金善元，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32