vp28基因和eGFP基因在蓝藻中的融合表达及分析制造技术

本发明专利技术涉及属于蓝藻生物工程、藻类分子生物学方向技术领域，特别涉及一种vp28基因和eGFP基因在蓝藻中的融合表达及分析，并构建穿梭载体的方法。本发明专利技术根据eGFP在荧光显微镜下受紫外光或蓝光激发后具有绿色荧光特性，通过构建vp28基因和eGFP基因的融合表达载体，充分利用eGFP基因的这一特性，使得vp28基因在聚球藻7942中的表达易于检测和定量分析，对使用转vp28基因的聚球藻作为口服剂，投喂南美白对虾，进行白斑综合征病毒的防治提供可靠依据。

Fusion expression and analysis of VP28 gene and eGFP gene in cyanobacteria

The invention relates to the field of cyanobacteria bioengineering and algal molecular biology direction technology, in particular to a fusion expression and analysis of VP28 gene and eGFP gene in cyanobacteria, and to build a shuttle carrier. According to the invention of eGFP under UV or blue light irradiation with green fluorescence under the fluorescence microscope, the expression vector to construct VP28 fusion gene and eGFP gene, make full use of the characteristic of eGFP gene, the VP28 gene is expressed in the detection and quantification of Synechococcus in 7942, the use of VP28 transgenic Synechococcus sp. as an oral agent, feeding Penaeus vannamei, to provide a reliable basis for comprehensive prevention and control of white spot syndrome virus.

【技术实现步骤摘要】
vp28基因和eGFP基因在蓝藻中的融合表达及分析
本专利技术涉及属于蓝藻生物工程、藻类分子生物学方向
，特别涉及一种vp28基因和eGFP基因在蓝藻中的融合表达及分析方法。
技术介绍
对虾白斑综合征病毒(WhiteSpotSyndromeVirus,WSSV)是养虾业中危害最严重的病毒之一，至今尚无规模应用的有效药物防治，但近年来WSSV防治在免疫上进展较大。VP28蛋白是WSSV囊膜上的主要结构蛋白，2004年以来其编码基因已在8种宿主中表达成功并用作口服剂，本研究根据eGFP在荧光显微镜下受紫外光或蓝光激发后具有绿色荧光特性，通过构建vp28基因和eGFP基因的融合表达载体，充分利用eGFP基因的这一特性，使得vp28基因在聚球藻7942中的表达易于检测和定量分析，使用转vp28基因的聚球藻作为口服剂，投喂南美白对虾，进行白斑综合征病毒的防治提供可靠依据。
技术实现思路
本专利技术公开一种vp28基因和eGFP基因在蓝藻中的融合表达及分析方法，本专利技术可以使用转vp28基因的聚球藻作为口服剂，投喂南美白对虾，进行白斑综合征病毒的防治提供可靠依据。为解决上述技术问题，本专利技本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种vp28基因和eGFP基因在蓝藻中的融合表达方法，包括如下步骤：(1)载体的构建：对489质粒进行全序列测序，并整理出489质粒中的酶切位点，先通过KpnI酶切489质粒，再通过限制酶XhoI进行第二次酶切反应；电泳回收大片段；所述KpnI酶切10μl反应体系中：0×Buffer L：1‑2μl，限制酶KpnI：1‑2μl，质粒DNA：1‑22μl，ddH2O：剩余；37℃保温2‑3h，80℃灭活20mins；所述XhoI酶切10μl反应体系中：0×Buffer L：1‑2μl，限制酶XhoI：1‑2μl，质粒DNA：1‑2μl，ddH2O：剩余；37℃保温2‑3h，80℃灭活20‑30m...

【技术特征摘要】
1.一种vp28基因和eGFP基因在蓝藻中的融合表达方法，包括如下步骤：(1)载体的构建：对489质粒进行全序列测序，并整理出489质粒中的酶切位点，先通过KpnI酶切489质粒，再通过限制酶XhoI进行第二次酶切反应；电泳回收大片段；所述KpnI酶切10μl反应体系中：0×BufferL：1-2μl，限制酶KpnI：1-2μl，质粒DNA：1-22μl，ddH2O：剩余；37℃保温2-3h，80℃灭活20mins；所述XhoI酶切10μl反应体系中：0×BufferL：1-2μl，限制酶XhoI：1-2μl，质粒DNA：1-2μl，ddH2O：剩余；37℃保温2-3h，80℃灭活20-30mins；(2)vp28+egfp引物设计扩增：设计引物进行PCR并与步骤(2)中大片段连接，经过重叠PCR反应，得到vp28和egfp融合的片段vp28+egfp；(3)大肠杆菌质粒制备：取30-50μL菌液加入5mL无菌LB培养液,37℃180-220rpm，过夜培养9-12h，将过夜培养的转化后的大肠杆菌用干净的LB培养液充分清洗后提取大肠杆菌质粒；使用引物vp28上游和vp28下游对大肠杆菌质粒与片段vp28+egfp进行PCR得到重组质粒489-vp28-eGFP。2.一种权利要求1所述的vp28基因和eGFP基因在蓝藻中的融合表达分析方法，包括如下步骤：S1：供体菌大肠杆菌转化与筛选：每50μl大肠杆菌感受态细胞中加入3-5μl重组质粒489-vp28-eGFP，轻轻混匀，冰浴30-40mins后，42℃80-100s热休克，迅速冰浴2-3min使体系冷却，过程中保持体系平稳，加入450-500μlLB培养液，37℃150rpm培养40-50mins；取100μl上述培养后大肠杆菌菌液加入抗生素的LB平板上，正放0.8-1.2h使菌液充分吸收，倒置培养10-12h后进行筛选，得到供体菌489-vp28-eGFP大肠杆菌；S2：滤膜制备：制备所选蓝藻对应的培养液，将0.45μm滤膜浸泡其中，高压灭菌20mins；S3：供体菌和辅助菌大肠杆菌的制备：首先分别将1ml步骤S1得到的供体菌489-vp28-eGFP大肠杆菌与1ml辅助菌含PR4+PRL542的大肠杆菌混合菌液接到40-50mlLB中37℃，200rpm活化2-3h，然后进行离心收菌，回收4-5ml菌用LB冲洗后离心，用400-500μlLB将所收菌重悬，获得重悬后的供体菌489-vp28-eGFP大肠杆菌与辅助菌含PR4+PRL54...

【专利技术属性】
技术研发人员：贾睿，庄旻敏，施定基，隋臣超，苏永政，吴倩萍，殷嵘，朱嘉诚，何培民，
申请(专利权)人：上海海洋大学，
类型：发明
国别省市：上海,31