确定miR-27a基因的核心启动子及其内转录因子Myod结合位点的方法技术

本发明专利技术提供确定miR‑27a基因的核心启动子的方法，从小鼠血液基因组DNA中扩增8条miR‑27a启动子缺失片段，构建重组双荧光素酶表达载体pGL3‑D1到pGL3‑D8，转入CHO细胞后检测8个缺失片段的荧光素酶活性，获得核心启动子区；该方法鉴定了miR‑27a的核心区，为基因工程和分子育种提供了新的启动子资源；本发明专利技术还提供确定miR‑27a基因核心启动子内转录因子Myod结合位点的方法，通过超表达转录因子Myod和定点突变核心启动子区内的转录因子结合位点，构建突变型荧光表达载体，检测荧光素酶活性，确定转录因子结合位点；为miR‑27a的表达调控运用于家畜高繁殖力分子调控机制的研究提供依据。

Method for determining the core promoter of miR-27a gene and its Myod binding site

The present invention provides a method to determine the core promoter of the miR 27a gene. The deletion fragment of 8 miR 27a promoter is amplified from the mouse blood genome DNA, and the recombinant double luciferase expression vector D1 to pGL3 D8 is constructed and the fluorescein activity of the 8 missing fragments is detected and the core promoter region is obtained. The method has identified the core area of miR 27a, providing new promoter resources for genetic engineering and molecular breeding. The invention also provides a method to determine the Myod binding site of the internal transcription factor of the core promoter of the miR 27a gene, which is constructed by overexpressing the transcription factor Myod and the transcription factor binding site in the promoter region of the fixed-point mutation core. A mutant fluorescent expression vector is used to detect the activity of luciferase and determine the binding site of the transcription factor, which provides a basis for the study of the regulation of miR 27a expression in the regulation mechanism of high fecundity in domestic animals.

【技术实现步骤摘要】
确定miR-27a基因的核心启动子及其内转录因子Myod结合位点的方法
本专利技术涉及分子遗传学领域，尤其涉及确定miR-27a基因的核心启动子及miR-27a基因的核心启动子内转录因子Myod结合位点的方法。
技术介绍
我国是畜牧业大国，畜牧业在国民经济中占有重要地位。繁殖和生长是决定规模化养殖产出的两大主要经济性状，在畜牧业中，母畜繁殖效益在总效益中占据更大的比例。繁殖性状具有遗传力低、选择周期长、选育进展慢等缺陷，成为制约畜牧业经济效益的主要原因。排卵率是产仔数性状的重要组分性状，卵巢中卵泡的生长发育决定了排卵数。因此探索卵巢中卵巢细胞基因表达情况、发育规律和调控因素，对于揭示排卵率的遗传调控机制，进行高繁殖力品种的选育具有重要意义。MicroRNA(miRNA)是一类内源性的具有调控功能的非编码RNA，长度一般为16-29核苷酸(nucleotide,nt)，与靶基因mRNA的3’-UTR结合来调控靶基因转录后表达。MiRNA作为一种小分子序列，可以全局调控基因的表达，功能涉及到组织生长、细胞凋亡、脂肪代谢、卵细胞发育、精子发生等重要生命过程。对于卵泡发育而言，miR-27a本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种确定miR‑27a基因的核心启动子的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤11、根据NCBI数据库中小鼠miR‑27a的5’‑UTR 2000bp序列(核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示)设计8条上游缺失片段引物(PF1‑PF8)和1条共用下游引物(PR)；引物核苷酸序列如SEQ ID NO：2—SEQ ID NO：10所示；步骤12、以小鼠血液全基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应(PCR)进行缺失片段的扩增，获得8段长度依次截短的miR‑27a的5’‑UTR序列片段，核苷酸序列如SEQ ID NO：11—SEQ ID NO：18所示；对上述8段序列和pGL3‑Basic载体质粒依次...

【技术特征摘要】
1.一种确定miR-27a基因的核心启动子的方法，其特征在于，包括以下步骤：步骤11、根据NCBI数据库中小鼠miR-27a的5’-UTR2000bp序列(核苷酸序列如SEQIDNO：1所示)设计8条上游缺失片段引物(PF1-PF8)和1条共用下游引物(PR)；引物核苷酸序列如SEQIDNO：2—SEQIDNO：10所示；步骤12、以小鼠血液全基因组DNA为模板，利用聚合酶链式反应(PCR)进行缺失片段的扩增，获得8段长度依次截短的miR-27a的5’-UTR序列片段，核苷酸序列如SEQIDNO：11—SEQIDNO：18所示；对上述8段序列和pGL3-Basic载体质粒依次经限制性内切酶酶切、琼脂糖凝胶电泳和切胶纯化处理；将处理好的8段序列和pGL3-Basic载体质粒利用T4连接酶进行连接，然后转入大肠杆菌DH5α内，平板培养获取单菌落；最后提取菌液内质粒，通过测序确定载体构建完成；步骤13、将CHO细胞进行培养，接种到细胞培养板中，待密度达到80％后进行转染操作，内参选择海肾荧光素酶pRL-TK，对CHO细胞进行转染；步骤14、转染24h后，利用细胞裂解液获得总蛋白，取含少量所述总蛋白的裂解液加入双荧光素酶报告基因检测试剂盒中配制的工作液，通过双荧光素酶报告基因对获得的总蛋白进行双荧光素酶活性检测。2.如权利要求1所述的确定miR-27a基因的核心启动子的方法，其特征在于，所述步骤13中将CHO细胞进行培养，接种到24孔细胞培养板中，待密度达到80％后进行转染操作，转染时，在OPTI-DMEM中混合重组质粒/Lipofectamine3000，对CHO细胞进行转染。3.如权利要求1所述的确定miR-27a基因的核心启动子的方法，其特征在于，所述步骤14中转染24h后，利用细胞裂解液获得总蛋白，取10ul含蛋白的裂解液加入双荧光素酶报告基因检测试剂盒中配制的工作液，利用酶标仪读取荧光值。4.如权利要求1所述的确定miR-27a基因的核心启动子的方法，其特征在于，所述的双荧光素酶报告基因为萤火虫荧光素酶基因。5.如权利要求1所述的确定miR-27a基因的核心启动子的方法，其特征在于，在步骤11中，所述8条上游缺失片段...

【专利技术属性】
技术研发人员：陶虎，陈明新，熊琪，张凤，李晓锋，索效军，张年，杨前平，刘洋，张鹤山，田宏，熊军波，
申请(专利权)人：湖北省农业科学院畜牧兽医研究所，
类型：发明
国别省市：湖北,42