一种基于CRISPR/Cas9体系的同源修复载体构建方法技术

本发明专利技术涉及一种基于CRISPR/Cas9体系的同源修复载体构建方法，属于基因工程技术领域；其步骤为：以质粒PCBC与野生型拟南芥基因组为模板，通过PCR分别扩增含打靶序列的目的条带AS‑gRNA与AS同源修复模板片段，电泳、切胶回收目的条带；将质粒PHDE‑mCH用Bsa1酶切；将酶切完全的PHDE‑mCh载体与ASgRNA经同源重组酶组装连接，形成重组质粒PHDE‑ASgRNA，转化和测序鉴定，再将测序正确的PHDE‑ASgRNA质粒用EcoR1酶切后与AS同源修复模板片段同源重组酶连接，经转化和测序鉴定，构建PHDE‑ASgRNA‑AS同源修复载体，本发明专利技术技术能真正实现对目标生物基因组的定点编辑功能的CRISPR/Cas9系统的方法，载体构建只需通过一步PCR，简单易行，无需对酶切载体与PCR产物纯化回收，组装效率高。

【技术实现步骤摘要】
一种基于CRISPR/Cas9体系的同源修复载体构建方法
本专利技术涉及一种基于CRISPR/Cas9体系的同源修复载体构建方法，具体涉及一种用于构建cDNA文库构建筛选的质粒载体的方法，属于基因工程

技术介绍
CRISPR/Cas9基因组定向编辑技术是近几年发展起来的对基因组进行定向精确修饰的一种技术。通过将外源的DNA导入受体细胞染色体的特定位点上，从而特异地改造基因组，研究基因的功能。该技术可以对基因组中的靶位点进行缺失、敲入、核苷酸修正等操作。2013年，科学家第一次将CRISPR/Cas9应用到人类和小鼠细胞系中对基因进行敲除，随后人们在模式植物和其他农作物中也成功获得了应用，经过改造的CRISPR/Cas9系统也迅速地被应用到拟南芥、烟草、高粱、水稻、小麦、玉米等不同植物基因组的定向编辑研究中，并且获得较高的诱导突变率和可稳定遗传的基因组编辑植株。相对于转基因技术，CRISPR/Cas9系统具有操作简单、快捷、不需要巨大的资金投入、在遗传编辑之后不留下转基因的痕迹，无须引用外源基因，因而生物安全性高，不具有转基因争议。目前为止，利用CRISPR/Cas9统实现基因组的定向编辑还只能对内源基因的定向敲除，还无法实现定点引入外源基因，对全面研究基因的功能起到一定的限制作用。因此，以现有的CRISPR/Cas9载体为基础，构建一种能实将外源基因定点交换到内源基因位置，真正实现对目标生物基因组的定点编辑功能的CRISPR/Cas9系统，为植物定点转基因改良、新基因定点引入等具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种能实将外源基因定点交换到内源基因位置，真正实现对目标生物基因组的定点编辑功能的CRISPR/Cas9系统的方法，载体构建只需通过一步PCR，简单易行，无需对酶切载体与PCR产物纯化回收，组装效率高。为实现上述专利技术的目的，本专利技术采取的技术方案如下：一种基于CRISPR/Cas9体系的同源修复载体构建方法，包括如下步骤：(1)靶位点设计sgRNA靶位点的选择使用CRISPR在线设计工具(http://crispr.dbcls.jp/)，以拟南芥AS基因为靶基因，选择靠近5'端得分最高的G-N19-NGG23bp序列，其中第一个G是小RNA转录的起始信号位点，NGG是Cas9基因定位的PAM序列，需要插入gRNA载体的是G-N19共20bp序列，共设计两个打靶位点的Target，实现大片段敲除；同时在AS基因的打靶载体上装入AS基因的同源修复片段，实现AS基因在CAS9敲除的同时，以载体上的AS基因的同源臂做模板进行修复。(2)引物设计所用引物见表1。表1本研究所用引物信息Table1Primersμsedinthisstμdy注：下划线部分表示同源末端序列，加粗斜体部分为靶位点序列Note,ΜnderlinedisthehomologoμsarmsofPHDEandtheboldseqμenceisthetargetlocμs.(3)打靶载体PHDE-ASgRNA的构建①PCR扩增目的片段：PCR反应总体积共100μL，平均分装至2个PCR小管；PCR反应条件为98℃预热4min，40个循环(98℃45s，55℃10s，72℃30s)，72℃保温；②琼脂糖凝胶电泳纯化与目的片段回收：1.5％琼脂糖凝胶电泳PCR产物，在紫外透照台上切下目的条带，将目的条带装入1.5mLEP管，-4℃冷冻20min，15000rpm低温离心20min，吸取上清液于PCR小管中，测定浓度，记录OD260/OD280，-20℃保存；③PHDE质粒的酶切和鉴定：酶切体系总体积20μL，50℃恒温过夜，然后以酶切前的PHDE质粒作对照，配制0.5％的琼脂糖凝胶进行电泳分析；④目的片段与载体重组：取一个PCR小管，先后加入0.3μL线性化PHDE载体、3μL重组酶以及1.2μL回收的AS基因片段，采用重组酶技术，将回收纯化后的AS基因片段与BsaI酶切线性化的载体重组连接，组装条件为50℃恒温反应1h；⑤重组子转化与鉴定：将重组产物利用热击法转化DH5a感受态大肠杆菌，复苏培养12h，挑单菌落摇床培养3～4h，做菌液PCR鉴定，用0.5％琼脂糖凝胶电泳分析，PCR反应条件为：94℃3min，30个循环(94℃30S，55℃30S,72℃45S)，72℃2min；⑥重组质粒的提取和鉴定：将阳性克隆过夜培养后用碱裂解法提取质粒，测定浓度，记录OD260/OD280，以该质粒为模板进行PCR分析，用1.2％浓度的琼脂糖凝胶电泳PCR产物，0.5％浓度的琼脂糖凝胶电泳提取的重组质粒；⑦重组质粒送样测序：将质粒PCR鉴定为阳性的质粒送至生工广州分公司测序验证，测序引物为Μ626-IDF。(4)同源重组修复模板载体PHDE-ASgRNA-AS的构建①PCR扩增AS基因同源臂片段：PCR反应体系与前述相同，总体积共100μL，混匀后平均分装至2个PCR小管，PCR反应条件为98℃预热4min，40个循环(98℃45s，55℃10s，72℃30s)，72℃保温；②琼脂糖凝胶电泳纯化与目的片段回收：将1.5％琼脂糖凝胶电泳后切胶回收目的条带，测浓度，记录OD260/OD280，-20℃保存；③PHDE-ASgRNA质粒的酶切和鉴定：酶切体系总体积20μL，37℃恒温反应15min，用0.5％琼脂糖凝胶进行电泳分析；④目的片段与载体重组：取PCR小管，先后加入0.3μL线性化PHDE-ASgRNA载体、3μL重组酶以及1.2μL回收的同源臂片段，组装条件为50℃恒温反应1h；⑤重组子转化与鉴定：将重组产物利用热击法转化DH5a感受态大肠杆菌，复苏培养12h，挑单菌落摇床培养3～4h，做菌液PCR鉴定，用0.5％琼脂糖凝胶电泳分析；PCR反应条件为：94℃3min，30个循环(94℃30S，55℃30S,72℃45S)，72℃2min；⑥重组质粒的提取和鉴定：将阳性克隆过夜培养后提取质粒，测定浓度，记录OD260/OD280，以该质粒为模板进行PCR分析，用1.2％浓度的琼脂糖凝胶电泳PCR产物，0.5％浓度的琼脂糖凝胶电泳提取的重组质粒；⑦重组质粒送样测序：将质粒PCR鉴定为阳性的质粒送样到生工广州分公司测序，测序引物为EcoR1-F。本专利技术的有益效果是：(1)PHDE-ASgRNA-AS重组质粒是在PHDE-ASgRNA重组质粒的基础上，在特定位点装入与AS基因敲除序列同源但缺失部分碱基序列的同源臂(EcoR1位点插入)，作为同源重组修复的模板，达到定点引入回复突变基因的目的。(2)采用同源重组技术，通过PCR扩增目的条带、回收，载体的酶切线性化，组装等过程将基因敲除目标片段与同源重组修复臂片段先后克隆到同一载体上，能实将外源基因定点交换到内源基因位置，真正实现对目标生物基因组的定点编辑功能的CRISPR/Cas9系统的方法，载体构建只需通过一步PCR，简单易行，无需对酶切载体与PCR产物纯化回收，组装效率高。具体实施方式下面通过实例对本专利技术做进一步详细说明，这些实例仅用来说明本专利技术，并不限制本专利技术的范围。采用粗皮桉无菌苗下胚轴为外植体进行组培再生，具体方法如下：1拟南芥幼苗的培植取50-80粒种子于1.5mL离本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基于CRISPR/Cas9体系的同源修复载体构建方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)靶位点设计sgRNA靶位点的选择使用CRISPR在线设计工具，以拟南芥AS基因：序列1为靶基因，选择靠近5'端得分最高的G‑N19‑NGG 23bp序列，其中第一个G是小RNA转录的起始信号位点，NGG是Cas9基因定位的PAM序列，需要插入gRNA载体的是G‑N19共20bp序列，共设计两个打靶位点的Target，实现大片段敲除；同时在AS基因的打靶载体上装入AS基因的同源修复片段，实现AS基因在CAS9敲除的同时，以载体上的AS基因的同源臂做模板进行修复；(2)进行引物设计As‑gRNA‑F序列2：

【技术特征摘要】
1.一种基于CRISPR/Cas9体系的同源修复载体构建方法，其特征在于：包括如下步骤：(1)靶位点设计sgRNA靶位点的选择使用CRISPR在线设计工具，以拟南芥AS基因：序列1为靶基因，选择靠近5'端得分最高的G-N19-NGG23bp序列，其中第一个G是小RNA转录的起始信号位点，NGG是Cas9基因定位的PAM序列，需要插入gRNA载体的是G-N19共20bp序列，共设计两个打靶位点的Target，实现大片段敲除；同时在AS基因的打靶载体上装入AS基因的同源修复片段，实现AS基因在CAS9敲除的同时，以载体上的AS基因的同源臂做模板进行修复；(2)进行引物设计As-gRNA-F序列2：CTAGAGTCGAAGTAGTGATTGGCGGGATCACTGGGTTAGGGTTTTAGAGCTAGAAATAGCAs-gRNA-R序列3：TGCTATTTCTAGCTCTAAAACTCTCACCATCCTTCTTCATCAATCTCTTAGTCGACTCTAEcoR1-F序列4：TAATTGATTGACAACGAATTGCGCAGCTGCAGCCACTGTGEcoR1-R序列5：ACAGCTATGACATGATTACGGGGAAGAAGTGATGTCAGGAμ626-IDF序列6：TGTCCCAGGATTAGAATGATTAGGC(3)打靶载体PHDE-ASgRNA的构建①PCR扩增目的片段：PCR反应总体积共100μL，平均分装至2个PCR小管；PCR反应条件为98℃预热4min，40个循环98℃45s，55℃10s，72℃30s，72℃保温；②琼脂糖凝胶电泳纯化与目的片段回收：1.5％琼脂糖凝胶电泳PCR产物，在紫外透照台上切下目的条带，将目的条带装入1.5mLEP管，-4℃冷冻20min，15000rpm低温离心20min，吸取上清液于PCR小管中，测定浓度，记录OD260/OD280，-20℃保存；③PHDE质粒的酶切和鉴定：酶切体系总体积20μL，50℃恒温过夜，然后以酶切前的PHDE质粒作对照，配制0.5％的琼脂糖凝胶进行电泳分析；④目的片段与载体重组：取一个PCR小管，先后加入0.3μL线性化PHDE载体、3μL重组酶以及1.2μL回收的AS基因片段，采用重组酶技术，将回收纯化...

【专利技术属性】
技术研发人员：欧阳乐军，李莉梅，徐锡荣，刘雅丽，柳镜炬，梁裕华，
申请(专利权)人：广东石油化工学院，
类型：发明
国别省市：广东,44