一种DNA序列编辑的方法技术

本发明专利技术提供了一种DNA序列编辑的方法，具体地本发明专利技术的方法采用两步替换法来进行DNA序列编辑，其中第一步为替换目标位点附近的一段序列(或为插入一段外源的DNA序列)，第二步将替换(或插入)的外源DNA序列切开，筛选外源DNA重组片段与基因组进行DNA重组之后得到的细胞，从而上述目标位点附近的序列替换为目标序列。结合CRISPR技术或其它技术，本发明专利技术可以高效、快速地进行染色体任意位点，并且可以进行任何形式的突变(包括突变、删除、插入外源DNA序列)等。

【技术实现步骤摘要】
一种DNA序列编辑的方法
本专利技术涉及生物
，具体地本专利技术涉及一种DNA序列编辑的方法，尤其涉及一种能够快速、高效进行基因组定点突变、删除和定点插入外源DNA序列的方法。
技术介绍
基因组编辑是指在基因组上进行特定位点的突变、敲入、删除等。该技术不仅在科研领域受到了极大重视，而且在农业和医疗领域的潜力也备受关注。具体的应用包括：(1)构建模式动物，帮助科学研究；(2)改造植物的性状，提高作物产量和逆境耐受能力等；(3)检测和改造人的基因，达到精准医疗的目的等。得益于宿主自身的同源重组，科学家能够对基因组DNA进行基因敲除、外源DNA插入等实验。然而，由于同源重组的效率比较低，需要引入筛选标记(如抗性基因DNA序列等)以用于后续的筛选，从而实现基因敲除和DNA插入的目的。到了2000年，BarryL.Wanner实验室开发了Red重组系统，大大提高了DNA重组的效率，也降低了对重组的DNA同源臂长度的要求(只需要36-50nt的同源序列即可)(KirillA.DatsenkoandBarryL.Wanner(2000).One-stepinactivationofchromosomalgenesinEscherichiacoliK-12usingPCRproducts.PNAS,97,6640-6645)。尽管如此，进行基因组编辑时，还是需要引入抗性基因等筛选标记以用于阳性克隆的筛选。为了去除阳性克隆内的筛选标记序列，需要在筛选标记序列两端加入FRT等重组位点，并通过引入Flp重组酶来介导两个FRT位点间进行位点特异性重组，以删除两个FRT位点间的筛选标记序列。类似的位点特异性重组系统还包括Cre重组酶和LoxP重组位点等。这类技术虽然可以成功消除筛选标记序列，但是会留下一个FRT重组位点(或其它类似重组位点)，无法实现基因组无痕编辑(如定点突变等)的需求。然而，要在哺乳动物细胞的基因组上进行定点编辑等实验仍然比较麻烦，而且效率很低。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种DNA序列编辑的方法及适用该方法的试剂盒。本专利技术的第一方面，提供了一种DNA序列编辑方法，所述方法包括步骤：提供第一DNA重组片段，所述第一DNA重组片段具有第一筛选标记，和供酶切割的切割位点，通过同源重组将所述第一DNA重组片段整合入所述DNA序列待编辑位点的一侧；提供第二DNA重组片段，所述第二DNA重组片段具有与所述第一DNA重组片段中的所述切割位点两侧序列同源的同源臂；酶切割整合入所述DNA序列的所述第一DNA重组片段，在所述切割位点形成切口，通过同源重组将所述第二DNA重组片段整合入待编辑DNA序列中，从而实现所述DNA序列编辑。在另一优选例中，所述“整合”包括替换目标DNA序列的一段序列或向目标DNA序列中插入一段外源的DNA序列。在另一优选例中，所述第二DNA重组片段中包括替代序列，通过同源重组将待编辑位点替换为所述替代序列。在另一优选例中，所述方法包括步骤：(1)在待编辑DNA序列内设定第一识别位点所述第一识别位点位于待编辑位点附近的一侧或该位点上；(2)提供第一DNA重组片段所述第一DNA重组片段具有第一筛选标记，第二识别位点和位于所述第一筛选标记两侧的同源臂，所述同源臂与所述第一识别位点两侧的序列同源；(3)第一次同源重组在所述第一识别位点切开待编辑DNA序列，通过同源重组将所述第一DNA重组片段整合入待编辑位点的一侧；(4)提供第二DNA重组片段所述第二DNA重组片段具有与所述第二识别位点两侧序列同源的同源臂；(5)第二次同源重组在所述第二识别位点切开DNA序列，通过同源重组将所述第二DNA重组片段整合入待编辑DNA序列中，从而实现所述DNA序列编辑。在另一优选例中，所述第二DNA重组片段中包括替代序列，在步骤(5)中通过第二次同源重组，将所述待编辑位点替换为所述替代序列。在另一优选例中，所述第二识别位点位于所述第一筛选标记内。在另一优选例中，所述步骤(5)中通过第二次同源重组去除第一次同源重组中整合入的外源DNA序列。在另一优选例中，所述DNA序列编辑方法为对基因组特定位点进行编辑的方法。在另一优选例中，所述同源臂的长度为39bp以上；优选为约40bp-1000bp。在另一优选例中，所述第一识别位点和所述第二识别位点分别独立地选自：酶切位点(如归位核酸内切酶酶切位点，优选为I-SceI，I-CeuI)、CRISPR系统切割位点、TALEN切割位点、ZFN切割位点、Argonaute切割位点中的任意一种或几种。在另一优选例中，所述第一识别位点和所述第二识别位点分别为不同的CRISPR系统切割位点。在另一优选例中，所述步骤(3)中，通过CRISPR系统在所述第一识别位点切开待编辑DNA序列。在另一优选例中，所述步骤(5)中，通过CRISPR系统在在所述第二识别位点切开待编辑DNA序列。在另一优选例中，所述CRISPR系统为CRISPR/Cas9系统。在另一优选例中，所述CRISPR系统为CRISPR/Cpf1系统。在另一优选例中，所述第一筛选标记选自：抗生素抗性基因、荧光蛋白表达基因、营养缺陷型筛选基因、和负筛选基因。在另一优选例中，所述DNA序列为原核生物基因组。在另一优选例中，所述DNA序列为真核生物基因组，优选为哺乳动物细胞基因组。在另一优选例中，所述DNA序列包括除基因组外的DNA序列，包括但不限于：质粒、cosmid、fosmid、BAC、YAC、其它人工染色体等。在另一优选例中，所述同源重组为λ-RED介导的高效同源重组。本专利技术的第二方面，提供了一种用于DNA序列编辑的试剂盒，所述试剂盒用于执行本专利技术第一方面所述的的方法。在另一优选例中，所述试剂盒包括：(A)第一DNA重组片段所述第一DNA重组片段具有第一筛选标记，第二识别位点和位于所述第一筛选标记两侧的同源臂，所述同源臂与所述第一识别位点两侧的序列同源；和/或(B)第二DNA重组片段所述第二DNA重组片段具有与所述第二识别位点两侧的序列同源的同源臂。在另一优选例中，所述试剂盒还包括：DNA酶切试剂。在另一优选例中，所述DNA酶切试剂选自下组：核酸内切酶试剂(如归位核酸内切酶试剂，优选为I-SceI，I-CeuI)、CRISPR-Cas试剂、TALEN试剂、ZFN试剂和Argonaute试剂。应理解，在本专利技术范围内中，本专利技术的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。附图说明图1为本专利技术一种实施例中基因组定点编辑的流程示意图；图2为本专利技术通过PCR方法验证转化子阳性克隆的电泳图片；图3为本专利技术通过PCR方法验证阳性克隆的测序结果分析图片；图4为本专利技术实施例3中所获得amilGFP插入菌株与野生型对照菌株的荧光图片。图5a为本专利技术实施例4中frr基因GTG启动子之前插入氨苄抗生素抗性基因及RBS序列的测序比对图片；图5b为本专利技术实施例4中在frr基因GTG启动子后面插入6个His编码基因的测序结果图。具体实施方式本专利技术人通过广泛而深入的研究，获得一种高效的基因编辑方法，该方法采用两步替换法来进行基因组编辑，其中第一步为替换目标位点附近的一段序列(或为本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种DNA序列编辑方法，其特征在于，所述方法包括步骤：提供第一DNA重组片段，所述第一DNA重组片段具有第一筛选标记，和供酶切割的切割位点，通过同源重组将所述第一DNA重组片段整合入所述DNA序列待编辑位点的一侧；提供第二DNA重组片段，所述第二DNA重组片段具有与所述第一DNA重组片段中的所述切割位点两侧序列同源的同源臂；酶切割整合入所述DNA序列的所述第一DNA重组片段，在所述切割位点形成切口，通过同源重组将所述第二DNA重组片段整合入待编辑DNA序列中，从而实现所述DNA序列编辑。

【技术特征摘要】
1.一种DNA序列编辑方法，其特征在于，所述方法包括步骤：提供第一DNA重组片段，所述第一DNA重组片段具有第一筛选标记，和供酶切割的切割位点，通过同源重组将所述第一DNA重组片段整合入所述DNA序列待编辑位点的一侧；提供第二DNA重组片段，所述第二DNA重组片段具有与所述第一DNA重组片段中的所述切割位点两侧序列同源的同源臂；酶切割整合入所述DNA序列的所述第一DNA重组片段，在所述切割位点形成切口，通过同源重组将所述第二DNA重组片段整合入待编辑DNA序列中，从而实现所述DNA序列编辑。2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法包括步骤：(1)在待编辑DNA序列内设定第一识别位点所述第一识别位点位于待编辑位点的一侧或该位点上；(2)提供第一DNA重组片段所述第一DNA重组片段具有第一筛选标记，第二识别位点和位于所述第一筛选标记两侧的同源臂，所述同源臂与所述第一识别位点两侧的序列同源；(3)第一次同源重组在所述第一识别位点切开待编辑DNA序列，通过同源重组将所述第一DNA重组片段整合入待编辑位点的一侧；(4)提供第二DNA重组片段所述第二DNA重组片段具有与所述第二识别位点两侧序列同源的同源臂；(5)第二次同源重组在所述第二识别位点切开DNA序列，通过同源重组将所述第二DNA重组片段整合入待编辑DNA序列中，从而实现所述DNA序列编辑。3.如权利要求2所述的方法，其特征在于，所述第二DNA重组片段中包括替代序列，在步骤(5)中通过第二次同源重组，将所述待编辑位点替换为所述替代序列。4.如权利要求2所述的方法，其...

【专利技术属性】
技术研发人员：王金，赵国屏，张宏，
申请(专利权)人：中国科学院上海生命科学研究院，
类型：发明
国别省市：上海,31