一种毕赤酵母载体及其制备方法和重组毕赤酵母菌株技术

本发明专利技术提供一种毕赤酵母载体的制备方法，包括将包含α分泌信号肽基因和多克隆位点的基因片段正向插入毕赤酵母胞内表达载体上的单克隆位点中。可获得携带α分泌信号肽并具有多克隆位点的毕赤酵母空载体，实现了不同目的基因的定向克隆和在毕赤酵母菌中的蛋白表达与分泌，并免于抗生素筛选。此外，本发明专利技术还提供一种毕赤酵母载体，以及应用该载体构建得到的重组毕赤酵母菌株。

【技术实现步骤摘要】
一种毕赤酵母载体及其制备方法和重组毕赤酵母菌株
本专利技术涉及基因工程领域，尤其涉及一种毕赤酵母载体及其制备方法和重组毕赤酵母菌株。
技术介绍
毕赤酵母是真菌表达体系家族的重要一员，利用它作为宿主进行外源基因的表达已经得到越来越多的应用。目前利用毕赤酵母进行蛋白表达的载体主要分为两大类：胞内表达载体和分泌型载体。其中，典型的胞内表达载体如质粒pAO815，如图1所示，该载体只有1个单克隆位点EcoRI，外源基因插入载体后需要确定正确的插入方向才能进行蛋白的表达，且蛋白表达后无法分泌到培养基中，需要对酵母细胞进行破壁处理再进行收集，增加了工艺步骤和生产成本，此外，由于该载体上存在His4基因，可以与毕赤酵母his4菌株进行互补，为选择毕赤酵母重组菌株提供筛选标记，具体地，在电转化酵母后能整合到酵母的基因组上，只有整合成功的毕赤酵母可以在组氨酸营养缺陷型培养基(如MD平板)上生长，整合到GS115菌株获得的表型为His+Mut+，从而在不需要采用抗生素进行阳性转化子的筛选的情况下获得目的表型菌株。而质粒pPIC9K和质粒pPICZαA均为典型的分泌型表达载体，均携带有α分泌信号肽基因和抗生素标记，其中，α分泌信号肽基因表达的α分泌信号肽是使目的基因表达的蛋白分泌的细胞外的关键；除此之外，与胞内表达载体不同的是，其以抗生素标记作为筛选标记，在质粒电转进入酵母后，抗生素基因即整合到毕赤酵母基因组上，使得该毕赤酵母具有相应的抗生素抗性，因而可以在含特定抗生素的培养基中生长，从而利用该方法可以获得转化成功的毕赤酵母重组菌株，例如，pPIC9K携带有G418(遗传霉素)标记，在表达外源蛋白时需要采用抗生素G418筛选高拷贝表达菌株，但G418价格昂贵，采用G418进行体内筛选高拷贝菌株的成功率较低。而pPICZαA携带博来霉素标记，则需要采用博来霉素进行筛选，但是，博来霉素具有毒性，价格不菲，操作过程需要避光，在实际工业生产中，采用大量的抗生素会增加成本，且存在相应的潜在风险。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种经改造的毕赤酵母载体及其制备方法和应用，该载体携带有α分泌信号肽基因以及便于目的基因定向插入的多克隆位点，能适用不同来源和种类的目的基因的导入，避免了为获得不同分泌型重组载体的反复构建，且在导入目的基因后，能方便获得免抗生素筛选的分泌型高拷贝表达菌株，且简化了操作步骤，降低了生产成本，提高了安全性。为了实现本专利技术的目的，本专利技术首先提供一种毕赤酵母载体的制备方法，其步骤包括：将包含α分泌信号肽基因的基因片段正向插入毕赤酵母胞内表达载体上的单克隆位点中，得到α重组载体，其中，所述基因片段还包括位于α分泌信号肽基因上游的EcoRI位点和下游的多克隆位点，其中，所涉及的酶切位点包括经酶切的相应黏性末端。可选地，所述基因片段插入所述毕赤酵母胞内表达载体上的单克隆位点后获得包含如SEQIDNO:1所示核苷酸序列的α重组载体。可选地，所述基因片段还包括位于α分泌信号肽基因与其上游EcoRI之间的Kozak序列。可选地，所述胞内表达载体为pAO815。可选地，所述多克隆位点为顺次连接的BsmI、AvrII、NotI和EcoRI。可选地，所述制备方法还包括，采用SEQIDNO:9和SEQIDNO:10所示序列为引物扩增毕赤酵母分泌型载体中的α分泌信号肽基因，并经EcoRI酶切，得到带相应黏性末端的所述基因片段。可选地，所述制备方法的步骤还包括：采用定点突变法，选择性地对α重组载体上的酶切位点进行改造，所述α重组载体上的酶切位点包括位于α分泌信号肽基因内及其上下游的酶切位点。所述制备方法的步骤还包括：采用定点突变法，将如图3所示的位于所述α重组载体上依次含EcoRI位点、Kozak序列、α分泌信号肽基因、BsmI位点、AvrII位点、NotI位点和EcoRI位点的核苷酸序列改造为如图4所示的依次含Kozak序列、α分泌信号肽基因、EcoRI位点、AvrII位点、NotI位点和XhoI位点的核苷酸序列。进一步地，所述依次含EcoRI位点、Kozak序列、α分泌信号肽基因、BsmI位点、AvrII位点、NotI位点和EcoRI位点的核苷酸序列如SEQIDNO:1所示；所述依次含Kozak序列、α分泌信号肽基因、EcoRI位点、AvrII位点、NotI位点和XhoI位点的核苷酸序列如SEQIDNO:2所示；可选地，所述胞内表达载体为pAO815，所述引物突变法的步骤包括：对所述α重载体的SEQIDNO:1所示核苷酸序列，采用SEQIDNO:3和SEQIDNO:4所示引物定点突变掉Kozak序列上游的EcoRI酶切位点；采用SEQIDNO:5和SEQIDNO:6所示引物定点突变掉α信号肽序列中的XhoI酶切位点，同时将α分泌信号肽下游端的α个BsmI位点突变为EcoRI；采用SEQIDNO:7和SEQIDNO:8所示引物定点突变掉NotI酶切位点下游的EcoRI酶切位点，同时引入XhoI酶切位点。可选地，采用所述定点突变法用于将如SEQIDNO:1所示序列的基因片段突变为SEQIDNO:2所示序列的基因片段。可选地，所述毕赤酵母分泌型载体选自pPIC9K、pPICZαA、pPICZαB或pPICZαC。为了实现本专利技术的目的，本专利技术还提供一种毕赤酵母载体，其由前面所述毕赤酵母载体的制备方法所制备得到。一种毕赤酵母载体，其包括pAO815质粒除去单克隆位点以外的全长基因和如SEQIDNO:2所示的核苷酸序列。前面所述毕赤酵母载体在构建含目的基因且免抗生素筛选的分泌型重组表达载体中的应用，包括：将待表达的目的基因插入前面所述毕赤酵母载体的多克隆位点。一种毕赤酵母重组载体，其包括前面所述毕赤酵母载体除多克隆位点以外的全长基因和待表达的目的基因。为了实现本专利技术的目的，本专利技术还提供一种重组毕赤酵母菌株，所述重组毕赤酵母菌中含有由前面所述的毕赤酵母载体与目的基因构建得到的免抗生素筛选的分泌型重组表达载体。本专利技术的有益效果本专利技术提供一种毕赤酵母重组载体及其制备方法和应用，通过将包含α分泌信号肽基因和至少一个酶切位点的基因片段正向插入毕赤酵母胞内表达载体上的单克隆位点中，获得一种新的毕赤酵母载体，可实现不同目的基因的定向克隆插入和在毕赤酵母菌中的蛋白表达与分泌，避免了为获得不同分泌型重组载体的反复构建，且连入载体时有更多的可选择酶切位点，便于实现定向克隆，避免了酶连后需进行方向验证来筛选连入方向正确的转化子，并能在α分泌信号肽的作用下，方便获得免抗生素进行阳性转化子筛选的分泌型表达菌株，无需破壁收集，又避免工业化生产中抗生素的使用。并具有表达和分泌所述目的基因编码的蛋白的功能此外，在α分泌信号肽基因上游引入KOZAK序列，进一步加强了插入的目的基因编码蛋白的表达，通过引物突变改变酶切位点，进一步提高了目的基因引入的便利性和适用广度。附图说明图1为胞内表达载体pAO815质粒的图谱；图2为本专利技术实施例2经定点突变后获得的毕赤酵母载体的图谱；图3为引物定点突变前载体中α片段的酶切位点图谱；图4为引物定点突变后载体中α片段的酶切位点图谱；图5为构建pAO815α质粒后经PstI和XhoI双切后的凝胶电泳验证结果；其中，M为含本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种毕赤酵母载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法的步骤包括：将包含α分泌信号肽基因的基因片段，正向插入毕赤酵母胞内表达载体上的单克隆位点中，得到α重组载体，其中，所述基因片段还包括位于α分泌信号肽基因上游的EcoRI位点和下游的多克隆位点。

【技术特征摘要】
1.一种毕赤酵母载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法的步骤包括：将包含α分泌信号肽基因的基因片段，正向插入毕赤酵母胞内表达载体上的单克隆位点中，得到α重组载体，其中，所述基因片段还包括位于α分泌信号肽基因上游的EcoRI位点和下游的多克隆位点。2.根据权利要求1所述的毕赤酵母载体的制备方法，其特征在于，所述基因片段还包括位于α分泌信号肽基因与其上游EcoRI位点之间的Kozak序列。3.根据权利要求1所述的毕赤酵母载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括:采用SEQIDNO:9和SEQIDNO:10所示序列为引物扩增毕赤酵母分泌型载体中的α分泌信号肽基因，并经EcoRI酶切，得到带相应黏性末端的所述基因片段,其中，所述多克隆位点为顺次连接的BsmI、AvrII、NotI和EcoRI位点。4.根据权利要求1所述的毕赤酵母载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法的步骤还包括：采用定点突变法，选择性地对所述α重组载体上的酶切位点进行改造，所述α重组载体上的酶切位点包括位于α分泌信号肽基因内及其上下游的酶切位点。5.根据权利要求3所述的毕赤酵母载体的制备方法，其特征在于，所述制备方法的步骤还包括：采用定点突变法，将所述α重组载体上依次含有EcoRI位点、KozaK序列、α分泌信号肽基因、BsmI位点、AvrII位点、NotI位点和EcoRI位点的且如SEQIDNO:1所示核苷酸序列改造为含Kozak序列、α分...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈小茹，王敏，王瑶琪，吴传侠，
申请(专利权)人：深圳上泰生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44