本发明专利技术涉及靶向编辑水牛18S rDNA基因的技术领域，特别涉及一种应用腺病毒系统靶向编辑水牛18S rDNA基因的方法，发明专利技术利自主构建的18S基因编辑载体对水牛的18S rDNA基因进行编辑，构建的腺病毒载体包含Cas9蛋白和sgRNA，再将载体进行腺病毒包装。利用Cas9编辑基因的准确高效性、腺病毒对外源基因承载能力强和腺病毒对原代细胞感染能力强的特性对水牛的18S rDNA基因进行编辑，克服水牛原代细胞难转染的瓶颈，所包装的腺病毒，能高效率地感染水牛原代乳腺上皮细胞并高效编辑水牛18SrDNA基因。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及靶向编辑水牛18SrDNA基因的
，特别涉及一种应用腺病毒系统靶向编辑水牛18SrDNA基因的方法。
技术介绍
水牛具有耐高温高湿、抗病、耐粗饲、易饲养的生物学特性，适合在中国南方进行养殖。广西广泛养殖水牛，由于水牛具有泌乳量低、产仔率低等特点，近年来，在分子生物学领域通过利用基因工程技术对水牛相关基因进行编辑，从而达到提高水牛泌乳量、产仔率的目的研究越来越多，而在分子生物学领域往往通过基因导入载体主要分为病毒载体和非病毒载体。而腺病毒载体由于外源基因承载能力强，且可感染处于静止期的细胞，病毒滴度高，不整合基因组，使其在转基因方面应用越来越广泛。例如，本专利技术人在《中国畜牧兽医》2016,43(10)：2661-2665的《腺病毒载体转染水牛不同原代体细胞的效果比较》一文中就有关于用腺病毒载体转染水牛乳腺上皮细胞、卵丘细胞、成纤维细胞的研究，但是，该项技术并没有披露关于利用人工构建的腺病毒载体靶向编辑水牛的18SrDNA的任何描述，由于核糖体基因18SrRNA基因序列及二级结构高度保守,在蛋白质合成中具有重要的功能，是至今发现的DNA序列中最为保守的一类，一般认为，如果某个基因编辑方法能对18SrDNA进行编辑，则证明该编辑该方法同样能对其它基因有着良好的基因编辑能力。
技术实现思路
鉴于上述内容，有必要提供一种应用腺病毒系统靶向编辑水牛18SrDNA基因的方法，能安全、高效的对水牛的18SrDNA基因进行有效编辑。为达到上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种应用腺病毒系统靶向编辑水牛18SrDNA基因的方法，所述方法包括如下步骤：(1)含有水牛18S基因片段的sn468-18S-1人工载体和sn468-18S-2人工载体构建：所述构建方法包括sn468载体的制备和sn468-18S-1、sn468-18S-2人工载体构建2个步骤；所述sn468载体的制备包括如下步骤：①用SalⅠ酶和NheⅠ酶对pUC57-U6质粒进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收获得U6-BsmbⅠ-gRNA目的基因片段，U6-BsmbⅠ-gRNA的基因序列如序列表13所示；②用SalⅠ酶和XbaⅠ酶对pDC316质粒进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收获得线性化的pDC316质粒；③将步骤①的U6-BsmbⅠ-gRNA目的基因片段和步骤②线性化的pDC316质粒进行T4连接，将连接产物导入感受态细胞DH5α进行转化，扩大培养，提取质粒进行序列测定，得到pDC316-U6载体。④用XbaⅠ酶和BamhⅠ酶对步骤③的pDC316-U6载体进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收获得线性化的pDC316-U6载体；⑤用XbaⅠ酶和BamhⅠ酶对sncas9载体进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收获得cas9目的基因片段；⑥将步骤④线性化的pDC316-U6载体和步骤⑤的cas9目的基因片段进行T4连接，将连接产物导入感受态细胞DH5α进行转化，扩大培养，提取质粒进行序列测定，得到载体sn468，载体sn468的序列如序列表14所示，用BsmBI酶对载体sn468进行酶切，得到带有BsmBI(粘性末端)的线性化sn468载体；所述sn468-18S-1、sn468-18S-2人工载体构建方法为：从基因数据库中下载水牛18S基因的核苷酸序列，得到18s基因的两个靶序列，分别命名为：18S靶序列1和18S靶序列2；根据gRNA的PAM设计原则，分别合成18S靶序列1和18S靶序列2的两对引物，引物分别命名为18S-1和18S-2，将18S-1和18S-2两对引物的上下游序列在10×LAPCRBuffer缓冲液、95℃水浴的条件下处理10min，然后经过自然降温3h，分别得到带有BsmBI(粘性末端)的18S-1引物二聚体和18S-2引物二聚体；将带有BsmBI(粘性末端)的18S-1引物二聚体和18S-2引物二聚体分别与步骤⑥带有BsmBI(粘性末端)的线性化sn468载体进行T4连接，将连接产物导入感受态细胞DH5α进行转化，扩大培养，得到sn468-18S-1人工载体和sn468-18S-2人工载体；所述18S靶序列1的序列为：5’-GAGGCCATGATTAAGAGGGA-3’；所述18S-1的上游引物序列为：5’-ACCGGAGGCCATGATTAAGAGGGA-3’；所述18S-1的下游引物序列为：5’-AAACTCCCTCTTAATCATGGCCTC-3’；所述18S靶序列2的序列为：5’-GCGGCGCAATACGAATGCCCC-3’；所述18S-2的上游引物序列为：5’-ACCGGCGGCGCAATACGAATGCCCC-3；所述18S-2的下游引物序列为：5’-AAACGGGGCATTCGTATTGCGCCGC-3’；(2)将步骤(1)的sn468-18S-1人工载体和sn468-18S-2人工载体与报告载体ERG进行连接，构建成ERG-#18S-1报告载体和ERG-#18S-2报告载体，并将步骤(1)的sn468-18S-1人工载体和sn468载体分别与人工报告载体进行混合、培养48h后进行荧光表达验证；所述构建ERG-#18S-1和ERG-#18S-2报告载体的方法为：合成与18S靶序列1和18S靶序列2相对应的ERG报告载体的2对引物，分别命名为#18S-1和#18S-2；分别将#18S-1和#18S-2两对引物的上下游序列在95℃的温度条件下处理15min，然后经过自然降温、过夜退火，分别得到带有EcoRⅠ(粘性末端)和BamHⅠ(粘性末端)的#18S-1引物二聚体和#18S-2引物二聚体；用EcoRⅠ酶和BamHⅠ酶对ERG报告载体进行线性化，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收获得带有EcoRⅠ(粘性末端)和BamHⅠ(粘性末端)的线性化ERG载体；用T4连接酶将带有EcoRⅠ(粘性末端)和BamHⅠ(粘性末端)的#18S-1引物二聚体和#18S-2引物二聚体分别与带有EcoRⅠ(粘性末端)和BamHⅠ(粘性末端)的线性化ERG载体进行连接，将连接产物导入感受态细胞进行转化，挑取单菌落培养，提取重组质粒，并通过测序验证，获得所述ERG-#18S-1和ERG-#18S-2报告载体；所述#18S-1的上游引物序列为：5’-AATTCGAGGCCATGATTAAGAGGGACGGG-3’；所述#18S-1的下游引物序列为：5’-GATCCCCGTCCCTCTTAATCATGGCCTCG-3’；所述#18S-2的上游引物序列为：5’-AATTCGCGGCGCAATACGAATGCCCCCGG-3’；所述#18S-2的下游引物序列为：5’-GATCCCGGGGGCATTCGTATTGCGCCGCG-3’；(3)筛选经过步骤(2)荧光表达验证后有编辑能力的sn468-18S-1和sn468-18S-2人工载体进行进行腺病毒包装，腺病毒包装方法为：将有编辑能力的sn468-18S-1和sn468-18S-2人工载体分别放入不含FBS的DMEM培养基中进行培养，然后与pBHGloxdeltaE13cre腺病毒骨架进行混合，并加入罗氏转染试本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种应用腺病毒系统靶向编辑水牛18S rDNA基因的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)含有水牛18S基因片段的sn468‑18S‑1人工载体和sn468‑18S‑2人工载体构建：所述构建方法包括sn468载体的制备和sn468‑18S‑1、sn468‑18S‑2人工载体构建2个步骤；所述sn468载体的制备包括如下步骤：①用Sal Ⅰ酶和Nhe Ⅰ酶对pUC57‑U6质粒进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收获得U6‑Bsmb Ⅰ‑gRNA目的基因片段；②用Sal Ⅰ酶和Xba Ⅰ酶对pDC316质粒进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收获得线性化的pDC316质粒；③将步骤①的U6‑Bsmb Ⅰ‑gRNA目的基因片段和步骤②线性化的pDC316质粒进行T4连接，将连接产物导入感受态细胞DH5α进行转化，扩大培养，提取质粒进行序列测定，得到pDC316‑U6载体。④用Xba Ⅰ酶和Bamh Ⅰ酶对步骤③的pDC316‑U6载体进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收获得线性化的pDC316‑U6载体；⑤用Xba Ⅰ酶和Bamh Ⅰ酶对sncas9载体进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收获得cas9目的基因片段；⑥将步骤④线性化的pDC316‑U6载体和步骤⑤的cas9目的基因片段进行T4连接，将连接产物导入感受态细胞DH5α进行转化，扩大培养，提取质粒进行序列测定，得到载体sn468，用BsmBI酶对载体sn468进行酶切，得到带有BsmBI(粘性末端)的线性化sn468载体；所述sn468‑18S‑1、sn468‑18S‑2人工载体构建方法为：从基因数据库中下载水牛18S基因的核苷酸序列，得到18s基因的两个靶序列，分别命名为：18S靶序列1和18S靶序列2；根据gRNA的PAM设计原则，分别合成18S靶序列1和18S靶序列2的两对引物，引物分别命名为18S‑1和18S‑2，将18S‑1和18S‑2两对引物的上下游序列在10×LA PCR Buffer缓冲液、95℃水浴的条件下处理10min，然后经过自然降温3h，分别得到带有BsmBI(粘性末端)的18S‑1引物二聚体和18S‑2引物二聚体；将带有BsmBI(粘性末端)的18S‑1引物二聚体和18S‑2引物二聚体分别与步骤⑥带有BsmBI(粘性末端)的线性化sn468载体进行T4连接，将连接产物导入感受态细胞DH5α进行转化，扩大培养，得到sn468‑18S‑1人工载体和sn468‑18S‑2人工载体；所述18S靶序列1的序列为：5’‑GAGGCCATGATTAAGAGGGA‑3’；所述18S‑1的上游引物序列为：5’‑ACCGGAGGCCATGATTAAGAGGGA‑3’；所述18S‑1的下游引物序列为：5’‑AAACTCCCTCTTAATCATGGCCTC‑3’；所述18S靶序列2的序列为：5’‑GCGGCGCAATACGAATGCCCC‑3’；所述18S‑2的上游引物序列为：5’‑ACCGGCGGCGCAATACGAATGCCCC‑3；所述18S‑2的下游引物序列为：5’‑AAACGGGGCATTCGTATTGCGCCGC‑3’；(2)将步骤(1)的sn468‑18S‑1人工载体和sn468‑18S‑2人工载体与报告载体ERG进行连接，构建成ERG‑#18S‑1报告载体和ERG‑#18S‑2报告载体，并将步骤(1)的sn468‑18S‑1人工载体和sn468载体分别与人工报告载体进行混合、培养48h后进行荧光表达验证；所述构建ERG‑#18S‑1和ERG‑#18S‑2报告载体的方法为：合成与18S靶序列1和18S靶序列2相对应的ERG报告载体的2对引物，分别命名为#18S‑1和#18S‑2；分别将#18S‑1和#18S‑2两对引物的上下游序列在95℃的温度条件下处理15min，然后经过自然降温、过夜退火，分别得到带有EcoR Ⅰ(粘性末端)和BamH Ⅰ(粘性末端)的#18S‑1引物二聚体和#18S‑2引物二聚体；用EcoR Ⅰ酶和BamH Ⅰ酶对ERG报告载体进行线性化，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收获得带有EcoR Ⅰ(粘性末端)和BamH Ⅰ(粘性末端)的线性化ERG载体；用T4连接酶将带有EcoR Ⅰ(粘性末端)和BamH Ⅰ(粘性末端)的#18S‑1引物二聚体和#18S‑2引物二聚体分别与带有EcoR Ⅰ(粘性末端)和BamH Ⅰ(粘性末端)的线性化ERG载体进行连接，将连接产物导入感受态细胞进行转化，挑取单菌落培养，提取重组质粒，并通过测序验证，获得所述ERG‑#18S‑1和ERG‑#18S‑2报告载体；所述#18S‑1的上游引物序列为：5’‑AATTCGAGGCCATGATTAAGAGGGACG...
【技术特征摘要】
1.一种应用腺病毒系统靶向编辑水牛18SrDNA基因的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)含有水牛18S基因片段的sn468-18S-1人工载体和sn468-18S-2人工载体构建：所述构建方法包括sn468载体的制备和sn468-18S-1、sn468-18S-2人工载体构建2个步骤；所述sn468载体的制备包括如下步骤：①用SalⅠ酶和NheⅠ酶对pUC57-U6质粒进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收获得U6-BsmbⅠ-gRNA目的基因片段；②用SalⅠ酶和XbaⅠ酶对pDC316质粒进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收获得线性化的pDC316质粒；③将步骤①的U6-BsmbⅠ-gRNA目的基因片段和步骤②线性化的pDC316质粒进行T4连接，将连接产物导入感受态细胞DH5α进行转化，扩大培养，提取质粒进行序列测定，得到pDC316-U6载体。④用XbaⅠ酶和BamhⅠ酶对步骤③的pDC316-U6载体进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收获得线性化的pDC316-U6载体；⑤用XbaⅠ酶和BamhⅠ酶对sncas9载体进行酶切，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收获得cas9目的基因片段；⑥将步骤④线性化的pDC316-U6载体和步骤⑤的cas9目的基因片段进行T4连接，将连接产物导入感受态细胞DH5α进行转化，扩大培养，提取质粒进行序列测定，得到载体sn468，用BsmBI酶对载体sn468进行酶切，得到带有BsmBI(粘性末端)的线性化sn468载体；所述sn468-18S-1、sn468-18S-2人工载体构建方法为：从基因数据库中下载水牛18S基因的核苷酸序列，得到18s基因的两个靶序列，分别命名为：18S靶序列1和18S靶序列2；根据gRNA的PAM设计原则，分别合成18S靶序列1和18S靶序列2的两对引物，引物分别命名为18S-1和18S-2，将18S-1和18S-2两对引物的上下游序列在10×LAPCRBuffer缓冲液、95℃水浴的条件下处理10min，然后经过自然降温3h，分别得到带有BsmBI(粘性末端)的18S-1引物二聚体和18S-2引物二聚体；将带有BsmBI(粘性末端)的18S-1引物二聚体和18S-2引物二聚体分别与步骤⑥带有BsmBI(粘性末端)的线性化sn468载体进行T4连接，将连接产物导入感受态细胞DH5α进行转化，扩大培养，得到sn468-18S-1人工载体和sn468-18S-2人工载体；所述18S靶序列1的序列为：5’-GAGGCCATGATTAAGAGGGA-3’；所述18S-1的上游引物序列为：5’-ACCGGAGGCCATGATTAAGAGGGA-3’；所述18S-1的下游引物序列为：5’-AAACTCCCTCTTAATCATGGCCTC-3’；所述18S靶序列2的序列为：5’-GCGGCGCAATACGAATGCCCC-3’；所述18S-2的上游引物序列为：5’-ACCGGCGGCGCAATACGAATGCCCC-3；所述18S-2的下游引物序列为：5’-AAACGGGGCATTCGTATTGCGCCGC-3’；(2)将步骤(1)的sn468-18S-1人工载体和sn468-18S-2人工载体与报告载体ERG进行连接，构建成ERG-#18S-1报告载体和ERG-#18S-2报告载体，并将步骤(1)的sn468-18S-1人工载体和sn468载体分别与人工报告载体进行混合、培养48h后进行荧光表达验证；所述构建ERG-#18S-1和ERG-#18S-2报告载体的方法为：合成与18S靶序列1和18S靶序列2相对应的ERG报告载体的2对引物，分别命名为#18S-1和#18S-2；分别将#18S-1和#18S-2两对引物的上下游序列在95℃的温度条件下处理15min，然后经过自然降温、过夜退火，分别得到带有EcoRⅠ(粘性末端)和BamHⅠ(粘性末端)的#18S-1引物二聚体和#18S-2引物二聚体；用EcoRⅠ酶和BamHⅠ酶对ERG报告载体进行线性化，将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，切胶回收获得带有EcoRⅠ(粘性末端)和BamHⅠ(粘性末端)的线性化ERG载体；用T4连接酶将带有EcoRⅠ(粘性末端)和BamHⅠ(粘性末端)的#18S-1引物二聚体和#18S-2引物二聚体分别与带有EcoRⅠ(粘性末端)和BamHⅠ(粘性末端)的线性化ERG载体进行连接，将连接产物导入感受态细胞进行转化，挑取单菌落培养，提取重组质粒，并通过测序验证，获得所述ERG-#18S-1和ERG-#18S-2报告载体；所述#18S-1的上游引物序列为：5’-AATTCGAGGCCATGATTAAGAGGGACGGG-3’；所述#...
【专利技术属性】
技术研发人员：梁贤威，朱鹏，段安琴，庞春英，邓廷贤，陆杏蓉，马小娅，梁莎莎，
申请(专利权)人：广西壮族自治区水牛研究所中国农业科学院水牛研究所，
类型：发明
国别省市：广西;45
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